Studiul concluzionează că virusul variolei maimuțelor poate fi detectat cu ușurință prin qPCR folosind trei teste validate clinic

Studiul concluzionează că virusul variolei maimuțelor poate fi detectat cu ușurință prin qPCR folosind trei teste validate clinic

Într-un studiu publicat recent medRxiv *, Cercetătorii au validat testele de reacție cantitativă a polimerazei în lanț (qPCR) a virusului variolei maimuței (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

fundal

Cazurile de variola la maimuta umana (MPX) au fost rareori detectate in afara tarilor cu MPXV, de la descoperirea sa in anii 1970. Această boală zoonotică a fost neglijată până la focarul în curs de desfășurare, în ciuda avertismentelor privind răspândirea globală și a dovezilor privind creșterea transmiterii de la om la om. Ca parte a focarului MPX în curs, au fost raportate peste 77.000 de cazuri de MPX din peste 100 de țări.

Cazurile de MPX pot prezenta febră, limfadenopatie și o erupție papilară. Persoanele imunodeprimate sunt expuse riscului de manifestări severe MPX și chiar de deces. Medicamentul antiviral Tecovirimat (Tpoxx) și vaccinul JYNNEOS, dezvoltat inițial pentru variolă, sunt singurele contramăsuri împotriva MPX. Deoarece detectarea precoce și rapidă a virusului este necesară pentru prevenirea și tratamentul MPX, dezvoltarea testelor qPCR este esențială pentru a perturba rețelele de transmisie.

Studiul și rezultatele

În prezentul studiu, cercetătorii au evaluat două teste qPCR specifice MPXV care vizează loci G2R și F3L și au comparat sensibilitatea, specificitatea și acuratețea acestora cu testul pan-ortopoxvirus al Centrelor pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) (OPXV-E9L). Autorii au achiziționat comercial ADN-ul MPXV sintetic (VR-3270SD) din cauza ofertei limitate de mostre clinice de MPXV și ADN genomic în primăvara anului 2022.

Șablonul achiziționat (VR-3270SD) a avut locuri de legare pentru primeri și sonde pentru numeroase teste dezvoltate anterior. Cercetătorii au estimat numărul exact de copii ale acestui standard prin PCR digitală cu picături (ddPCR) la 1,29 x 108 copii/ml pentru loci MPXV-F3L și OPXV-E9L și 1,3 x 108 copii/ml pentru locusul MPXV-G2R.

Autorii au testat 15 probe de tampon de piele pozitive pentru virusul herpes simplex (HSV), 17 pozitive pentru virusul varicelo-zoster (VZV) și 52 probe de tampon cutanat HSV/VZV negative utilizând testul OPXV-E9L și au verificat că au fost negative pentru MPXV. Testul F3L nu a detectat ADN MPXV în aceste probe, în timp ce în testul G2R, o probă pozitivă pentru VZV a fost găsită pozitivă pentru G2R, dar a fost testată negativă pentru G2R când a fost repetat.

Testele G2R și F3L au arătat un acord procentual negativ de 98,8% și, respectiv, 100% în 84 de probe. Apoi, echipa a testat reactivitatea încrucișată a testelor MPXV cu virusurile camelpox (CMLV), cowpox (CPXV) și vaccinia (VACV), care sunt rude filogenetice apropiate ale MPXV. Testele MPXV-F3L și G2R nu au detectat ADN-urile CMLV, CPXV și VACV, în timp ce testul OPXV-E9L a arătat praguri medii de ciclu (Ct) de 19,8, 25,8 și, respectiv, 23,8.

Carte electronică Genetică și Genomică

Compilare a celor mai bune interviuri, articole și știri din ultimul an. Descărcați o copie gratuită

Capacitatea de a detecta ADN-ul MPXV a fost evaluată folosind rezultate pozitive artificiale. Concordanța procentuală pozitivă a fost de 100% pentru testul OPXV E9L și 99,1% pentru testele MPXV G2R și F3L. În plus, au testat dacă testele G2R și F3L ar detecta cu acuratețe MPXV în probe (clinice) și au asigurat șapte probe de tampon de piele pozitive pentru MPXV dintr-un laborator de sănătate publică (PHL).

Probele PHL au fost diluate 1:40 înainte de extracție din cauza limitărilor de volum. Douăzeci de probe clinice MPXV care au fost testate pozitiv în testul F3L au fost testate simultan cu testele OPXV-E9L și MPXV-G2R. Testele specifice MPXV au avut, în medie, valori Ct mai mici decât testul OPXV-E9L pentru fiecare probă. În plus, testul G2R a avut o valoare Ct mai mică decât testul F3L în fiecare probă, în concordanță cu două copii G2R din genomul MPXV.

Cercetătorii au estimat limita de detecție (LoD) la 330 de copii/mL, ceea ce corespunde la 3,3 copii per reacție (PCR), folosind metode standard de extracție pentru testele MPXV F3L și G2R. De asemenea, au validat testul MPXV-F3L folosind diferite tipuri de probe, cum ar fi: B. LCR, urină, ser, plasmă, sânge integral și tampoane orale/rectale/nazofaringiene/vaginale.

Acordul procentual negativ a fost de 100% pentru toate tipurile de mostre. Concordanța procentuală pozitivă a fost de 100% pentru tampoanele nazofaringiene/rectale/vaginale, plasmă, LCR, sânge integral și lapte matern, 95,7% pentru probele de urină și 95,5% pentru probele de ser. LoD pentru aceste probe a fost estimat la 1000 de copii/mL (10 copii/mL per reacție).

Folosind probe clinice MPXV, acordul procentual negativ a fost de 100% pentru salivă, material seminal și tampoane rectale/orale/uscate. Concordanță procentuală pozitivă a fost de 100% pentru salivă, tampoane rectale și sperma și 95% pentru tampoane orale/uscate. LoD pentru testul F3L a fost de 260 de copii/ml pentru material seminal, 780 de copii/ml pentru tampoane cu saliva, rectale și orale și 810 copii/ frotiu pentru tampoane uscate.

Concluzii

În rezumat, prezentul studiu a evaluat sensibilitatea și specificitatea setului de primeri și sonde specifice MPXV împreună cu un test de pan-ortopoxvirus. LoD pentru aceste teste a fost de până la 3,3 copii per reacție (PCR) prin extracție de la până la 250 μL de probă. Niciuna dintre teste nu a arătat reactivitate încrucișată cu VZV sau HSV, indicând o specificitate ridicată.

În general, performanța celor trei teste pentru detectarea MPXV a fost comparabilă, fiecare fiind foarte sensibilă pentru ADN-ul MPXV. Testul MPXV-F3L a avut o specificitate ridicată pentru MPXV și nu a arătat nicio reactivitate încrucișată cu HSV sau alți ortopoxvirusuri și va fi un instrument critic în reducerea transmiterii MPXV în focarul în curs.

*NOTA importanta

medRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu au fost revizuite de colegi și, prin urmare, nu ar trebui să fie considerate concludente, să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

Referinţă:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.