Štúdia dospela k záveru, že vírus opičích kiahní možno ľahko detegovať pomocou qPCR pomocou troch klinicky overených testov

Štúdia dospela k záveru, že vírus opičích kiahní možno ľahko detegovať pomocou qPCR pomocou troch klinicky overených testov

V nedávno zverejnenej štúdii medRxiv *, Výskumníci potvrdili kvantitatívne testy polymerázovej reťazovej reakcie (qPCR) vírusu opičích kiahní (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

pozadia

Prípady ľudských opičích kiahní (MPX) boli zriedkavo zistené mimo krajín s endemickým výskytom MPXV od jeho objavenia v 70. rokoch 20. storočia. Táto zoonotická choroba bola zanedbávaná až do pokračujúceho prepuknutia choroby, napriek varovaniam o celosvetovom šírení a dôkazom o zvyšujúcom sa prenose z človeka na človeka. V rámci prebiehajúcej epidémie MPX bolo hlásených viac ako 77 000 prípadov MPX z viac ako 100 krajín.

Prípady MPX sa môžu prejaviť horúčkou, lymfadenopatiou a papilárnou vyrážkou. Imunokompromitovaní jedinci sú ohrození závažnými MPX prejavmi a dokonca smrťou. Antivírusový liek Tecovirimat (Tpoxx) a vakcína JYNNEOS, pôvodne vyvinutá proti pravým kiahňam, sú jedinými protiopatreniami proti MPX. Pretože na prevenciu a liečbu MPX je potrebná včasná a rýchla detekcia vírusu, vývoj testov qPCR je rozhodujúci pre narušenie prenosových sietí.

Štúdia a výsledky

V tejto štúdii výskumníci vyhodnotili dva testy qPCR špecifické pre MPXV zamerané na lokusy G2R a F3L a porovnali ich citlivosť, špecifickosť a presnosť s panortopoxvírusovým testom Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) (OPXV-E9L). Autori komerčne zakúpili syntetickú DNA MPXV (VR-3270SD) z dôvodu obmedzenej ponuky klinických vzoriek MPXV a genómovej DNA na jar 2022.

Zakúpený templát (VR-3270SD) mal väzbové miesta pre priméry a sondy pre mnohé predtým vyvinuté testy. Výskumníci odhadli presný počet kópií tohto štandardu pomocou kvapôčkovej digitálnej PCR (ddPCR) na 1,29 x 108 kópií/ml pre lokusy MPXV-F3L a OPXV-E9L a 1,3 x 108 kópií/ml pre lokus MPXV-G2R.

Autori testovali 15 vzoriek kožných výterov pozitívnych na vírus herpes simplex (HSV), 17 pozitívnych na vírus varicella-zoster (VZV) a 52 HSV/VZV negatívnych vzoriek pomocou testu OPXV-E9L a overili, že sú negatívne na MPXV. Test F3L nezistil DNA MPXV v týchto vzorkách, zatiaľ čo v teste G2R sa zistilo, že vzorka pozitívna na VZV je pozitívna na G2R, ale pri opakovaní bola testovaná ako G2R negatívna.

Testy G2R a F3L ukázali negatívnu percentuálnu zhodu 98,8 % a 100 % v 84 vzorkách. Ďalej tím testoval krížovú reaktivitu testov MPXV s vírusmi ťavích kiahní (CMLV), kravských kiahní (CPXV) a vakcínie (VACV), ktoré sú blízkymi fylogenetickými príbuznými MPXV. Testy MPXV-F3L a G2R nezistili DNA CMLV, CPXV a VACV, zatiaľ čo test OPXV-E9L ukázal priemerné prahové hodnoty cyklu (Ct) 19,8, 25,8 a 23,8.

Elektronická kniha Genetika a genomika

Kompilácia top rozhovorov, článkov a noviniek za posledný rok. Stiahnite si bezplatnú kópiu

Schopnosť detegovať MPXV DNA bola hodnotená pomocou umelých pozitívnych výsledkov. Pozitívna percentuálna zhoda bola 100 % pre test OPXV E9L a 99,1 % pre testy MPXV G2R a F3L. Okrem toho testovali, či testy G2R a F3L presne detegujú MPXV v (klinických) vzorkách a zabezpečili sedem vzoriek kožných výterov pozitívnych na MPXV z laboratória verejného zdravia (PHL).

Vzorky PHL boli pred extrakciou zriedené v pomere 1:40 z dôvodu obmedzenia objemu. Dvadsať klinických vzoriek MPXV, ktoré boli pozitívne testované v teste F3L, sa testovalo súčasne s testami OPXV-E9L a MPXV-G2R. Testy špecifické pre MPXV mali v priemere nižšie hodnoty Ct ako test OPXV-E9L pre každú vzorku. Okrem toho test G2R mal nižšiu hodnotu Ct ako test F3L v každej vzorke, čo je v súlade s dvoma kópiami G2R v genóme MPXV.

Výskumníci odhadli limit detekcie (LoD) na 330 kópií/ml, čo zodpovedá 3,3 kópiám na (PCR) reakciu s použitím štandardných extrakčných metód pre testy MPXV F3L a G2R. Validovali aj test MPXV-F3L s použitím rôznych typov vzoriek, ako sú: B. CSF, moč, sérum, plazma, plná krv a orálne/rektálne/nazofaryngeálne/vaginálne výtery.

Negatívna percentuálna zhoda bola 100 % pre všetky typy vzoriek. Pozitívna percentuálna zhoda bola 100 % pre nazofaryngeálne/rektálne/vaginálne výtery, plazmu, CSF, plnú krv a materské mlieko, 95,7 % pre vzorky moču a 95,5 % pre vzorky séra. LoD pre tieto vzorky sa odhadlo na 1000 kópií/ml (10 kópií/ml na reakciu).

Pri použití klinických vzoriek MPXV bola negatívna percentuálna zhoda 100 % pre sliny, spermu a rektálne/orálne/suché tampóny. Pozitívna percentuálna zhoda bola 100 % pre sliny, rektálne tampóny a spermie a 95 % pre orálne/suché tampóny. LoD pre test F3L bola 260 kópií/ml pre spermu, 780 kópií/ml pre sliny, rektálne a orálne výtery a 810 kópií/náter pre suché výtery.

Závery

Stručne povedané, táto štúdia hodnotila citlivosť a špecifickosť MPXV-špecifických súborov primérov a sond spolu s testom pan-ortopoxvírusu. LoD pre tieto testy bolo len 3,3 kópií na (PCR) reakciu extrakciou až z 250 ul vzorky. Žiadny z testov nepreukázal skríženú reaktivitu s VZV alebo HSV, čo naznačuje vysokú špecifickosť.

Celkovo bola výkonnosť troch testov na detekciu MPXV porovnateľná, pričom každý z nich bol vysoko citlivý na DNA MPXV. Test MPXV-F3L mal vysokú špecifickosť pre MPXV a nevykazoval žiadnu skríženú reaktivitu s HSV alebo inými ortopoxvírusmi a bude kritickým nástrojom pri znižovaní prenosu MPXV pri prebiehajúcej epidémii.

*Dôležitá POZNÁMKA

medRxiv zverejňuje predbežné vedecké správy, ktoré neboli recenzované, a preto by sa nemali považovať za presvedčivé, usmerňujú klinickú prax/správanie súvisiace so zdravím, ani by sa s nimi nemalo zaobchádzať ako s overenými informáciami.

Referencia:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.