Študija zaključuje, da je mogoče virus opičjih koz zlahka odkriti s qPCR s tremi klinično validiranimi testi

Študija zaključuje, da je mogoče virus opičjih koz zlahka odkriti s qPCR s tremi klinično validiranimi testi

V nedavno objavljeni študiji medRxiv *, Raziskovalci so potrdili teste kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) virusa opičjih koz (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

ozadje

Primeri človeških opičjih koz (MPX) so bili od odkritja v sedemdesetih letih 20. stoletja le redko odkriti zunaj držav, endemičnih za MPXV. Ta zoonotska bolezen je bila zanemarjena do trenutnega izbruha, kljub opozorilom o globalnem širjenju in dokazom o naraščajočem prenosu s človeka na človeka. Kot del potekajočega izbruha MPX so poročali o več kot 77.000 primerih MPX iz več kot 100 držav.

Primeri MPX se lahko kažejo z zvišano telesno temperaturo, limfadenopatijo in papilarnim izpuščajem. Imunsko oslabljeni posamezniki so v nevarnosti hudih manifestacij MPX in celo smrti. Protivirusno zdravilo Tecovirimat (Tpoxx) in cepivo JYNNEOS, prvotno razvito za črne koze, sta edina protiukrepa proti MPX. Ker je za preprečevanje in zdravljenje MPX potrebno zgodnje in hitro odkrivanje virusa, je razvoj testov qPCR ključnega pomena za prekinitev prenosnih omrežij.

Študija in rezultati

V tej študiji so raziskovalci ovrednotili dva testa qPCR, specifična za MPXV, ki ciljata na lokuse G2R in F3L, in primerjali njuno občutljivost, specifičnost in natančnost s testom pan-ortopoksvirusa Centra za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC) (OPXV-E9L). Avtorji so komercialno kupili sintetično DNK MPXV (VR-3270SD) zaradi omejene ponudbe kliničnih vzorcev MPXV in genomske DNK spomladi 2022.

Kupljena predloga (VR-3270SD) je imela vezavna mesta za primerje in sonde za številne predhodno razvite teste. Raziskovalci so ocenili natančno število kopij tega standarda s kapljičnim digitalnim PCR (ddPCR) na 1,29 x 108 kopij/ml za lokuse MPXV-F3L in OPXV-E9L ter 1,3 x 108 kopij/ml za lokus MPXV-G2R.

Avtorji so s testom OPXV-E9L testirali 15 vzorcev kožnih brisov, pozitivnih na virus herpes simpleks (HSV), 17 pozitivnih na virus varicella-zoster (VZV) in 52 negativnih na HSV/VZV, ter potrdili, da so negativni na MPXV. Test F3L v teh vzorcih ni zaznal DNK MPXV, medtem ko je bil v testu G2R vzorec, pozitiven na VZV, pozitiven na G2R, vendar je bil test G2R negativen, ko se je ponovil.

Testi G2R in F3L so pokazali negativno odstotno ujemanje 98,8 % oziroma 100 % pri 84 vzorcih. Nato je ekipa testirala navzkrižno reaktivnost testov MPXV z virusi kameljih koz (CMLV), kravjih koz (CPXV) in vakcinije (VACV), ki so bližnji filogenetski sorodniki MPXV. Testa MPXV-F3L in G2R nista odkrila DNK CMLV, CPXV in VACV, medtem ko je test OPXV-E9L pokazal povprečne pragove cikla (Ct) 19,8, 25,8 oziroma 23,8.

E-knjiga o genetiki in genomiki

Zbirka najboljših intervjujev, člankov in novic zadnjega leta. Prenesite brezplačno kopijo

Zmožnost zaznavanja DNK MPXV je bila ocenjena z uporabo umetnih pozitivnih rezultatov. Pozitivni odstotek strinjanja je bil 100 % za test OPXV E9L in 99,1 % za testa MPXV G2R in F3L. Poleg tega so preizkusili, ali bi testi G2R in F3L natančno odkrili MPXV v (kliničnih) vzorcih, in zagotovili sedem MPXV-pozitivnih vzorcev kožnih brisov iz laboratorija za javno zdravje (PHL).

Vzorci PHL so bili zaradi prostorninskih omejitev pred ekstrakcijo razredčeni 1:40. Dvajset kliničnih vzorcev MPXV, ki so bili pozitivni pri testu F3L, je bilo testiranih hkrati s testoma OPXV-E9L in MPXV-G2R. Testi, specifični za MPXV, so imeli v povprečju nižje vrednosti Ct kot test OPXV-E9L za vsak vzorec. Poleg tega je imel test G2R nižjo vrednost Ct kot test F3L v vsakem vzorcu, skladno z dvema kopijama G2R v genomu MPXV.

Raziskovalci so ocenili, da je meja detekcije (LoD) 330 kopij/ml, kar ustreza 3,3 kopijam na (PCR) reakcijo z uporabo standardnih ekstrakcijskih metod za teste MPXV F3L in G2R. Prav tako so validirali test MPXV-F3L z uporabo različnih vrst vzorcev, kot so: B. CSF, urin, serum, plazma, polna kri in brisi ust/rektal/nazofaringeal/vagina.

Negativni odstotek strinjanja je bil 100 % za vse vrste vzorcev. Pozitivni odstotek strinjanja je bil 100 % za nazofaringealne/rektalne/vaginalne brise, plazmo, cerebrospinalno tekočino, polno kri in materino mleko, 95,7 % za vzorce urina in 95,5 % za vzorce seruma. LoD za te vzorce je bil ocenjen na 1000 kopij/mL (10 kopij/mL na reakcijo).

Z uporabo kliničnih vzorcev MPXV je bil negativni odstotek strinjanja 100 % za slino, seme in rektalne/oralne/suhe brise. Pozitivni odstotek strinjanja je bil 100 % za slino, rektalne brise in seme ter 95 % za oralne/suhe brise. LoD za test F3L je bil 260 kopij/mL za seme, 780 kopij/mL za slino, rektalne in oralne brise ter 810 kopij/bris za suhe brise.

Sklepi

Če povzamemo, je ta študija ovrednotila občutljivost in specifičnost MPXV-specifičnih primerjev in nizov sond skupaj s pan-ortopoksvirusnim testom. LoD za te teste je bil le 3,3 kopije na (PCR) reakcijo z ekstrakcijo iz do 250 μL vzorca. Nobena od analiz ni pokazala navzkrižne reaktivnosti z VZV ali HSV, kar kaže na visoko specifičnost.

Na splošno je bila uspešnost treh testov za odkrivanje MPXV primerljiva, pri čemer je bil vsak zelo občutljiv za DNK MPXV. Test MPXV-F3L je bil visoko specifičen za MPXV in ni pokazal navzkrižne reaktivnosti s HSV ali drugimi ortopoksvirusi in bo ključno orodje za zmanjšanje prenosa MPXV v trenutnem izbruhu.

*Pomembna OPOMBA

medRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso bila strokovno pregledana in jih zato ne bi smeli šteti za dokončne, usmerjati klinično prakso/vedenje, povezano z zdravjem, ali jih obravnavati kot uveljavljene informacije.

Referenca:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.