Studien drar slutsatsen att appoxvirus lätt kan detekteras med qPCR med hjälp av tre kliniskt validerade analyser

Studien drar slutsatsen att appoxvirus lätt kan detekteras med qPCR med hjälp av tre kliniskt validerade analyser

I en nyligen publicerad studie medRxiv *, Forskare validerade appoxvirus (MPXV) kvantitativa polymeraskedjereaktionsanalyser (qPCR).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

bakgrund

Fall av mänskliga apkoppor (MPX) har sällan upptäckts utanför MPXV-endemiska länder sedan upptäckten på 1970-talet. Denna zoonotiska sjukdom försummades fram till det pågående utbrottet, trots varningar om global spridning och bevis på ökad överföring från människa till människa. Som en del av det pågående MPX-utbrottet har mer än 77 000 MPX-fall rapporterats från över 100 länder.

MPX-fall kan uppvisa feber, lymfadenopati och papillärt utslag. Immunförsvagade individer löper risk för allvarliga MPX-manifestationer och till och med dödsfall. Det antivirala läkemedlet Tecovirimat (Tpoxx) och vaccinet JYNNEOS, ursprungligen utvecklat för smittkoppor, är de enda motåtgärderna mot MPX. Eftersom tidig och snabb virusdetektering krävs för MPX-förebyggande och behandling, är utvecklingen av qPCR-analyser avgörande för att störa överföringsnätverk.

Studien och resultaten

I den aktuella studien utvärderade forskare två MPXV-specifika qPCR-analyser riktade mot G2R- och F3L-loci och jämförde deras känslighet, specificitet och noggrannhet med Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pan-orthopoxvirus-analys (OPXV-E9L). Författarna köpte syntetiskt MPXV-DNA (VR-3270SD) kommersiellt på grund av det begränsade utbudet av kliniska MPXV-prover och genomiskt DNA våren 2022.

Den köpta mallen (VR-3270SD) hade bindningsställen för primrar och prober för många tidigare utvecklade analyser. Forskarna uppskattade det exakta antalet kopior av denna standard genom droppe digital PCR (ddPCR) till 1,29 x 108 kopior/ml för MPXV-F3L och OPXV-E9L loci och 1,3 x 108 kopior/ml för MPXV-G2R locus.

Författarna testade 15 herpes simplex-virus (HSV)-positiva, 17 varicella-zoster-virus (VZV)-positiva och 52 HSV/VZV-negativa hudprover med användning av OPXV-E9L-analysen och verifierade att de var negativa för MPXV. F3L-analysen detekterade inte MPXV-DNA i dessa prover, medan i G2R-analysen fann man ett VZV-positivt prov positivt för G2R men testade G2R-negativt när det upprepades.

G2R- och F3L-analyserna visade en negativ procentuell överensstämmelse på 98,8 % respektive 100 % i 84 prover. Därefter testade teamet korsreaktiviteten av MPXV-analyser med kamkoppor (CMLV), kokoppor (CPXV) och vaccinia (VACV) virus, som är nära fylogenetiska släktingar till MPXV. MPXV-F3L- och G2R-analyserna detekterade inte DNA från CMLV, CPXV och VACV, medan OPXV-E9L-analysen visade genomsnittliga cykeltrösklar (Ct) på 19,8, 25,8 respektive 23,8.

Genetik och genomik e-bok

Sammanställning av de bästa intervjuerna, artiklarna och nyheterna från det senaste året. Ladda ner en gratis kopia

Förmågan att detektera MPXV-DNA bedömdes med hjälp av konstgjorda positiva resultat. Den positiva procentuella överensstämmelsen var 100 % för OPXV E9L-analysen och 99,1 % för MPXV G2R- och F3L-analyserna. Dessutom testade de om G2R- och F3L-analyser skulle detektera MPXV korrekt i (kliniska) prover och säkrade sju MPXV-positiva hudprover från ett folkhälsolaboratorium (PHL).

PHL-proverna späddes 1:40 före extraktion på grund av volymbegränsningar. Tjugo kliniska MPXV-prover som testade positivt i F3L-analysen testades samtidigt med OPXV-E9L- och MPXV-G2R-analyser. De MPXV-specifika analyserna hade i genomsnitt lägre Ct-värden än OPXV-E9L-analysen för varje prov. Dessutom hade G2R-analysen ett lägre Ct-värde än F3L-analysen i varje prov, vilket överensstämmer med två G2R-kopior i MPXV-genomet.

Forskarna uppskattade gränsen för detektion (LoD) till 330 kopior/ml, vilket motsvarar 3,3 kopior per (PCR)-reaktion med standardextraktionsmetoder för MPXV F3L- och G2R-analyser. De validerade också MPXV-F3L-analysen med hjälp av olika provtyper såsom: B. CSF, urin, serum, plasma, helblod och orala/rektala/nasofaryngeala/vaginala pinnprover.

Den negativa procentuella överensstämmelsen var 100 % för alla provtyper. Den positiva procentuella överensstämmelsen var 100 % för nasofaryngeala/rektala/vaginala pinnprover, plasma, CSF, helblod och bröstmjölk, 95,7 % för urinprover och 95,5 % för serumprover. LoD för dessa prover uppskattades till 1000 kopior/ml (10 kopior/ml per reaktion).

Med hjälp av kliniska MPXV-prover var negativ procentuell överensstämmelse 100 % för saliv, sperma och rektala/orala/torra pinnprover. Den positiva procentuella överensstämmelsen var 100 % för saliv, rektalprover och sperma och 95 % för orala/torra pinnprover. LoD för F3L-analysen var 260 kopior/ml för sperma, 780 kopior/ml för saliv, rektala och orala pinnprover och 810 kopior/utstryk för torra pinnprover.

Slutsatser

Sammanfattningsvis utvärderade den föreliggande studien känsligheten och specificiteten hos MPXV-specifika primer- och probuppsättningar tillsammans med en pan-ortopoxvirusanalys. LoD för dessa analyser var så låg som 3,3 kopior per (PCR) reaktion genom extraktion från upp till 250 μL prov. Ingen av analyserna visade korsreaktivitet med VZV eller HSV, vilket indikerar hög specificitet.

Sammantaget var prestandan för de tre analyserna för MPXV-detektion jämförbar, där var och en var mycket känslig för MPXV-DNA. MPXV-F3L-analysen hade hög specificitet för MPXV och visade ingen korsreaktivitet med HSV eller andra ortopoxvirus och kommer att vara ett viktigt verktyg för att minska MPXV-överföring under det pågående utbrottet.

*Viktig OBS

medRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte har granskats av experter och som därför inte ska anses vara avgörande, vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende eller behandlas som etablerad information.

Hänvisning:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.