该研究得出的结论是，使用三种经过临床验证的检测方法，可以通过 qPCR 轻松检测猴痘病毒

该研究得出的结论是，使用三种经过临床验证的检测方法，可以通过 qPCR 轻松检测猴痘病毒

在最近发表的一项研究中 医学Rxiv *，研究人员验证了猴痘病毒 (MPXV) 定量聚合酶链反应 (qPCR) 检测。

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

背景

自 20 世纪 70 年代发现人类猴痘 (MPX) 病例以来，在 MPXV 流行国家之外很少发现该病例。 尽管有警告称这种人畜共患病在全球范围内传播，并且有证据表明人与人之间的传播正在增加，但直到疫情持续爆发之前，这种人畜共患疾病仍被忽视。 作为正在进行的 MPX 疫情的一部分，100 多个国家已报告了 77,000 多例 MPX 病例。

MPX 病例可能会出现发烧、淋巴结肿大和乳头状皮疹。 免疫功能低下的个体面临严重 MPX 表现甚至死亡的风险。 抗病毒药物 Tecovirimat (Tpoxx) 和最初针对天花开发的疫苗 JYNNEOS 是针对 MPX 的唯一对策。 由于 MPX 预防和治疗需要早期和快速的病毒检测，因此 qPCR 检测的开发对于破坏传播网络至关重要。

研究及结果

在本研究中，研究人员评估了两种针对 G2R 和 F3L 位点的 MPXV 特异性 qPCR 检测，并将其敏感性、特异性和准确性与疾病控制和预防中心 (CDC) 泛正痘病毒检测 (OPXV-E9L) 进行比较。 由于 2022 年春季临床 MPXV 样本和基因组 DNA 供应有限，作者商业购买了合成 MPXV DNA (VR-3270SD)。

购买的模板 (VR-3270SD) 具有用于许多先前开发的检测的引物和探针的结合位点。 研究人员通过液滴数字 PCR (ddPCR) 估计该标准品的准确拷贝数对于 MPXV-F3L 和 OPXV-E9L 基因座为 1.29 x 108 拷贝/ml，对于 MPXV-G2R 基因座为 1.3 x 108 拷贝/ml。

作者使用 OPXV-E9L 检测检测了 15 份单纯疱疹病毒 (HSV) 阳性、17 份水痘带状疱疹病毒 (VZV) 阳性和 52 份 HSV/VZV 阴性皮肤拭子样本，并证实它们对 MPXV 呈阴性。 F3L 检测未检测到这些样本中的 MPXV DNA，而在 G2R 检测中，发现 VZV 阳性样本的 G2R 呈阳性，但重复检测时 G2R 呈阴性。

G2R 和 F3L 检测在 84 个样本中显示负一致性百分比分别为 98.8% 和 100%。 接下来，研究小组测试了 MPXV 检测与骆驼痘 (CMLV)、牛痘 (CPXV) 和牛痘 (VACV) 病毒的交叉反应性，这些病毒是 MPXV 的系统发育近亲。 MPXV-F3L 和 G2R 检测未检测到 CMLV、CPXV 和 VACV 的 DNA，而 OPXV-E9L 检测显示平均循环阈值 (Ct) 分别为 19.8、25.8 和 23.8。

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使用人工阳性结果评估检测 MPXV DNA 的能力。 OPXV E9L 测定的阳性一致性百分比为 100%，MPXV G2R 和 F3L 测定的阳性一致性百分比为 99.1%。 此外，他们还测试了 G2R 和 F3L 检测是否能够准确检测（临床）样本中的 MPXV，并从公共卫生实验室 (PHL) 获取了 7 个 MPXV 阳性皮肤拭子样本。

由于体积限制，PHL 样品在提取前按 1:40 稀释。 在 F3L 测定中检测呈阳性的 20 个临床 MPXV 样本同时与 OPXV-E9L 和 MPXV-G2R 测定进行测试。 对于每个样品，MPXV 特异性检测的平均 Ct 值低于 OPXV-E9L 检测。 此外，每个样本中 G2R 检测的 Ct 值均低于 F3L 检测，这与 MPXV 基因组中的两个 G2R 拷贝一致。

研究人员估计检测限 (LoD) 为 330 个拷贝/mL，相当于使用 MPXV F3L 和 G2R 检测的标准提取方法每个 (PCR) 反应 3.3 个拷贝。 他们还使用不同的样本类型验证了 MPXV-F3L 检测，例如：B. 脑脊液、尿液、血清、血浆、全血和口腔/直肠/鼻咽/阴道拭子。

所有样本类型的负百分比一致性均为 100%。 鼻咽/直肠/阴道拭子、血浆、脑脊液、全血和母乳的阳性百分比一致性为100%，尿液样本的阳性百分比一致性为95.7%，血清样品的阳性百分比一致性为95.5%。 这些样品的 LoD 估计为 1000 拷贝/mL（每个反应 10 拷贝/mL）。

使用临床 MPXV 样本，唾液、精液和直肠/口腔/干拭子的阴性百分比一致性为 100%。 唾液、直肠拭子和精液的阳性一致性百分比为 100%，口腔/干拭子的阳性一致性百分比为 95%。 F3L 检测的精液 LoD 为 260 拷贝/mL，唾液、直肠和口腔拭子为 780 拷贝/mL，干拭子为 810 拷贝/涂片。

结论

总之，本研究评估了 MPXV 特异性引物和探针组以及泛正痘病毒检测的敏感性和特异性。 通过从多达 250 μL 的样品中提取，这些检测的 LoD 低至每个 (PCR) 反应 3.3 个拷贝。 所有检测均未显示与 VZV 或 HSV 的交叉反应，表明特异性较高。

总体而言，三种 MPXV 检测方法的性能相当，每种方法对 MPXV DNA 都高度敏感。 MPXV-F3L 检测对 MPXV 具有高度特异性，并且与 HSV 或其他正痘病毒没有交叉反应，将成为减少当前疫情中 MPXV 传播的关键工具。

*重要注意事项

medRxiv 发布未经同行评审的初步科学报告，因此不应被视为结论性的、指导临床实践/健康相关行为的报告，或被视为既定信息。

参考：

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

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