Neue Erkenntnisse zeigen, warum der menschliche Darm T-Zellen auf einzigartige Weise Gluten präsentiert

Neue Erkenntnisse zeigen, warum der menschliche Darm T-Zellen auf einzigartige Weise Gluten präsentiert

Neue Erkenntnisse zeigen, dass menschliche M-Zellen als vollwertige Antigen-präsentierende Zellen fungieren und Glutenpeptide über einen dendritischen zellähnlichen Weg verarbeiten und präsentieren, der möglicherweise die frühe Immunität gegen Zöliakie prägt.

In einer kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Studie NaturForscher fanden heraus, dass Mikrofaltenzellen (M) im menschlichen Darm dendritischen Zellen (DCs) ähneln und Antigene über den Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse II (MHC-II) präsentieren. Die Studie zeigt insbesondere, dass die MHC-II-Expression konstitutiv und unabhängig von Interferon-gamma (IFNγ) erfolgt, was diese Zellen von Enterozyten unterscheidet, die für die MHC-II-Induktion Entzündungsreize benötigen und eher von IRF1 als von dem von M-Zellen verwendeten CIITA-abhängigen Signalweg abhängen.

M-Zellen sind seltene Epithelzellen, die sich im Follikel-assoziierten Epithel der Peyer-Plaques im Darm befinden und an der Immunität der Darmschleimhaut beteiligt sind. Sie transportieren luminale Antigene zu submukösen Immunzellen. Maus-M-Zellen stammen aus Darmstammzellen, benötigen den Rezeptoraktivator des Kernfaktor-Kappa-B-Liganden (RANKL), den SRY-Box-Transkriptionsfaktor 8 (SOX8), den Spi-B-Transkriptionsfaktor (SPIB) und exprimieren Glykoprotein 2 (GP2). Die Differenzierung menschlicher M-Zellen ist jedoch weitgehend unbekannt.

Organoidmodelle enthüllen die Entwicklung menschlicher M-Zellen

In der vorliegenden Studie entwickelten die Forscher ein intestinales Organoidmodell, um menschliche M-Zellen zu untersuchen und ihren Differenzierungsverlauf zu ermitteln. Das Team optimierte sein bisheriges Kulturprotokoll für menschliche Darmorganoide durch Zugabe von Retinsäure, RANKL und Tumornekrosefaktor (TNF). Dies führte zum Auftreten von GP2+-Zellen. In diesem Medium wurden SPIB-Reporterorganoide kultiviert, was zur effizienten Erzeugung von SPIB-exprimierenden Zellen führte.

Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzfärbung zeigten eine SPIB-Expression in über 75 % der Zellen, wobei etwa 3 % GP2 koexprimierten. Die koexprimierenden Zellen exprimierten auch andere M-Zellmarker, wie den CC-Motiv-Chemokin-Liganden 23 (CCL23) und SOX8. Von Organoiden abgeleitete Zellen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für die Analyse der Einzelzell-Ribonukleinsäuresequenzierung (scRNA-seq) sortiert.

Ein veröffentlichter scRNA-seq-Datensatz wurde erneut analysiert, um primäre M-Zell-Markergene zu identifizieren. Dieser Datensatz wurde in andere scRNA-seq-Ressourcen integriert, die alle anderen Darmzelltypen abdecken. Die Forscher bestimmten einen Kernsatz primärer M-Zellmarker, darunter SPIB, GP2, SOX8, Platelet-Activating-Factor-Rezeptor (PTAFR), GABA-Rezeptor-Untereinheit pi (GABRP) und Solute Carrier Family 2 Member 6 (SLC2A6). Diese Marker wurden in organoiden M-Zellen stark exprimiert.

Stadien der menschlichen M-Zell-Differenzierung

Über 90 % der GP2+ organoiden M-Zellen exprimierten das interzelluläre Adhäsionsmolekül 2 (ICAM2). Allerdings wurde ICAM2 auch von der Hälfte der GP2-Zellen exprimiert. Darüber hinaus könnten SPIB+ M-Linien-Organoidzellen in ICAM2+- und ICAM2–Untergruppen stratifiziert werden. Somit konnten Zellen der M-Linie in drei Stadien unterschieden werden: SPIB+ICAM2-GP2-frühe M-Zellen, SPIB+ICAM2+GP2-unreife M-Zellen und SPIB+ICAM2+GP2+ reife M-Zellen. Diese Populationen wurden für die transkriptomische Profilerstellung sortiert.

ICAM2+-Zellen wurden mit unreifen M-Zellmarkern angereichert, darunter CCL23, SOX8 und TNF-alpha-induziertes Protein 2 (TNFAIP2). Die Reifung der M-Zellen fiel mit dem Auftreten von auf RANKL reagierenden Genen zusammen. Das Team identifizierte 1.639 differentiell exprimierte Gene (DEGs) während der M-Zell-Differenzierung. Eine Analyse der Genontologie (GO), basierend auf hochregulierten und herunterregulierten DEGs in M-Zellen, ergab, dass M-Zellen und Enterozyten die relevantesten Zelltypen waren.

M-Zell-Organoide zeigten keine Marker für andere Darmzelltypen. Darüber hinaus spekulierte das Team, dass M-Zellen und DCs ein RANKL-induziertes Transkriptionsregulationsnetzwerk teilen könnten, da verschiedene RANKL-induzierte Transkriptionsfaktoren von M-Zellen aus der DC-Biologie bekannt sind und dass RANKL für die DC-Aktivierung essentiell ist. Die Forscher konzentrierten sich auf den Transkriptionsfaktor 2 der RUNX-Familie (RUNX2), einen RANKL-induzierten M-Zell-Transkriptionsfaktor, der wie SPIB ein Hauptregulator von DCs ist.

RANKL und RUNX2-Achse treiben die M-Zell-Reifung voran

Die Zugabe eines RUNX2-Inhibitors reduzierte dosisabhängig die Anzahl der GP2+ M-Zellen. Darüber hinaus führte der RUNX2-Knockout zu einer signifikanten Reduzierung der GP2+-Organoid-M-Zellen. Darüber hinaus untersuchte das Team den Datensatz für Rezeptoren, die von M-Zellen exprimiert werden. M-Zellen exprimierten die Rezeptoren Retinsäure, RANKL und TNF, was mit ihren funktionellen Wirkungen übereinstimmt. Anschließend wurde ein FACS-basiertes Screening durchgeführt, um Nischenfaktoren zu identifizieren, die die M-Zell-Reifung fördern.

Unter den 12 getesteten Liganden erhöhte der Kolonie-stimulierende Faktor 2 (CSF2) die GP2+-Organoid-M-Zellen um mehr als das Vierfache. Primäre menschliche M-Zellen exprimierten auch den CSF2-Rezeptor, was auf eine mögliche In-vivo-Funktion schließen lässt. Angesichts der gemeinsamen Signalregulatoren und Transkriptionsfaktoren zwischen DCs und M-Zellen untersuchten die Forscher zusätzliche DC-Gene im scRNA-seq-Datensatz. Das Team beobachtete die Induktion lymphoider DC-Markergene während der Reifung von M-Zellen.

Darüber hinaus wurden scRNA-seq-Datensätze von primären Darmepithelzellen und mehreren Immunzelltypen integriert. Eine unbeaufsichtigte Clusteranalyse ergab einen einzigartigen Cluster aus lymphoiden DCs und M-Zellen. Zu den Signaturgenen dieses Clusters gehörten lymphoide DC-Marker, die sowohl von M-Zellen als auch von lymphoiden DCs exprimiert wurden. Eine GO-Analyse basierend auf hochregulierten DEGs in M-Zellen ergab, dass Antigen-präsentierende Zellen (APCs) und aktivierte DCs die am engsten verwandten Zelltypen sind.

M-Zellen weisen dendritische APC-Merkmale auf

Darüber hinaus unterschied sich die Morphologie von FACS-sortierten M-Zellen von der von SPIB-Zellen in Kultur, wobei die Vorsprünge denen von DCs ähnelten. Darüber hinaus nahm die MHC-II-Genexpression während der M-Zell-Reifung zu, was durch Durchflusszytometrie bestätigt wurde, die eine MHC-II-Proteinexpression sowohl in GP2+- als auch in GP2-M-Zellen zeigte. Bemerkenswert ist, dass SPIB+-Zellen der M-Linie MHC-II-Proteine ​​exprimierten, SPIB–Zellen dagegen nicht.

Ohne M-Zell-induzierende Faktoren kultivierte Darmorganoide exprimierten kein MHC-II ohne IFNγ. Organoide M-Zellen zeigten jedoch eine spontane MHC-II-Expression in Abwesenheit von IFN-γ, was auf eine homöostatische Antigenpräsentationskapazität schließen lässt, die in Enterozyten nicht beobachtet wird, sofern sie nicht inflammatorischen Zytokinen ausgesetzt sind, und mit MIIC-Strukturen, die stärker entwickelt und dendritischer zellähnlich sind als diejenigen, die in IFNγ-stimulierten Enterozyten beobachtet werden. Als nächstes untersuchte das Team mithilfe der Immunelektronenmikroskopie das Vorhandensein des MHC-II-Kompartiments (MIIC), das Kennzeichen der Antigenpräsentation.

In M-Zellen wurden Strukturen beobachtet, die frühe, multivesikuläre, intermediäre und multilaminare MIICs darstellen und entsprechenden Strukturen in DCs ähnelten. Wie DCs exprimierten M-Zellen Komponenten der Antigenverarbeitungs- und Präsentationsmaschinerie sowie verschiedene Mustererkennungsrezeptoren. Wichtig ist, dass M-Zellen auch hohe Mengen an Transglutaminase 2 (TGM2) exprimierten, was die Desamidierung von Gliadinpeptiden in die krankheitsauslösenden Formen ermöglichte, die HLA-DQ2.5 binden.

Schließlich bestätigte ein T-Zell-Organoid-Kokultur-Assay, der sich auf die T-Zell-Aktivierung bei Zöliakie, einer Autoimmunerkrankung, konzentrierte, dass M-Zellen das Gluten-Antigen verarbeiten und präsentieren. Die Studie zeigte außerdem, dass die TGM2-Hemmung oder der TGM2-Knockout die T-Zell-Aktivierung reduzierte, dass M-Zellen naive CD4+ T-Zellen unter definierten Stimulationsbedingungen aktivieren konnten und dass sie co-stimulierende Moleküle wie CD80 und CD86 hochregulierten, was ihre Klassifizierung als professionelle APCs verstärkte.

Auswirkungen auf Immunität und Zöliakie

Insgesamt haben menschliche M-Zellen Ähnlichkeiten mit DCs und fungieren als professionelle, nicht hämatopoetische APCs. Maus-M-Zellen exprimieren kein MHC-II, weshalb die durch M-Zellen vermittelte Antigenpräsentation möglicherweise nur beim Menschen auftritt.

Angesichts der niedrigen IFNγ-Spiegel und der begrenzten mikrobiellen Exposition im fetalen und neonatalen Darm könnten M-Zellen durch konstitutive MHC-II-Expression als frühe APCs im Darmepithel fungieren.

M-Zellen verarbeiten und präsentieren auch das Gluten-Antigen, einschließlich seiner TGM2-abhängigen desamidierten Formen, was auf eine zentrale Rolle dieser Zellen bei Zöliakie schließen lässt. Die Autoren stellen jedoch fest, dass die organoiden Ergebnisse zwar überzeugend sind, der volle Beitrag von M-Zellen zur Antigenpräsentation in vivo jedoch noch innerhalb der komplexen lymphoiden Mikroumgebung des Darms ermittelt werden muss.

Quellen: