Exame de assinaturas plasmáticas de proteínas derivadas de plaquetas na embolia pulmonar aguda

Exame de assinaturas plasmáticas de proteínas derivadas de plaquetas na embolia pulmonar aguda

Num estudo recente publicado em Pesquisa de trombose, os pesquisadores determinaram assinaturas plasmáticas de proteínas relacionadas ou derivadas de plaquetas na embolia pulmonar aguda isolada (iPE) e na EP associada à trombose venosa profunda (TVP-EP) em comparação com a TVP isolada (iDVT).

Lernen: Subtypspezifische Plasmasignaturen der thrombozytenbezogenen Proteinfreisetzung bei akuter Lungenembolie. Bildquelle: Victor Josan/Shutterstock

fundo

Os dois principais subtipos de EP são iPE e TVP-PE, e estudos demonstraram que os perfis de proteínas plasmáticas diferem para estas duas doenças. As plaquetas atuam como ligantes celulares e facilitam a interferência inflamatória entre as células imunológicas e endoteliais durante alto estresse de cisalhamento arterial. Este processo envolve uma interação direta mediada por receptor entre moléculas pró-inflamatórias e vesículas extracelulares (EVs). No entanto, as respostas inflamatórias locais no endotélio sob baixo estresse de cisalhamento ativam as plaquetas para desencadear o desenvolvimento de tromboembolismo venoso (TEV) e seus subtipos, incluindo EP e TVP. Os mecanismos que controlam este processo são menos compreendidos.

Dados experimentais sugerem que as plaquetas contribuem para a tromboinflamação no sistema venoso, desencadeando processos inflamatórios e de coagulação. Por exemplo, usando o modelo de camundongo TEV, os pesquisadores demonstraram que as plaquetas interagem com células endoteliais expostas ao fator von Willebrand (VWF) e formam conjugados com leucócitos através da glicoproteína (GP) Ibα, além de desencadear o recrutamento endotelial e a coagulação dependente de leucócitos.

Experimentos humanos demonstraram diferentes características de ativação e reatividade plaquetária no TEV agudo. Por exemplo, plaquetas de pacientes com TEV agudo apresentaram maior exocitose de grânulos densos e lisossomos. Isto foi associado a níveis plasmáticos mais elevados de tromboxano B2, mas a menor formação de trombina dependente de plaquetas do que em pacientes com TEV excluído, independentemente da terapia com aspirina.

Estudos de espectrometria de massa (MS) detectaram mais de 3.700 proteínas em plaquetas humanas altamente purificadas quiescentes, inibidas e ativadas. Ensaios avançados baseados em imunoabsorção enzimática (ELISA) usando MS podem permitir a avaliação qualitativa de proteínas liberadas por plaquetas no plasma e em plaquetas isoladas. No entanto, falta uma análise mais detalhada das proteínas plasmáticas associadas às plaquetas em grandes coortes de TEV.

Sobre o estudo

No presente estudo de coorte prospectivo multicêntrico, os pesquisadores examinaram o plasma de 541 pacientes com TEV usando análise baseada em aprendizado de máquina. O objetivo era identificar assinaturas de proteínas plasmáticas para suposta liberação de plaquetas específicas para iPE e TVP-PE. Esses pacientes apresentavam TEV agudo no momento da admissão, diagnosticado por exames de imagem. Embora houvesse 99 pacientes com EPi, 282 eram pacientes com TVP-EP, e a equipe comparou seus dados com os de 160 pacientes com TVPi. A equipe utilizou ultrassom Doppler colorido de perna inteira e angiografia pulmonar por tomografia computadorizada (TC) para diagnosticar TVP e EP. Angiologistas e radiologistas certificados avaliaram e validaram todos os diagnósticos do estudo.

Eles coletaram amostras de estudo como parte do projeto Genotipagem e Fenotipagem Molecular de Tromboembolismo Venoso (GMP-VTE) conduzido na Alemanha. Os pesquisadores usaram a tecnologia de ensaio de extensão de proximidade (PEA) para perfis de proteínas plasmáticas altas e baixas a partir de amostras armazenadas a -80°C. A PEA determinou valores de expressão normalizada (NPX) para todas as proteínas plasmáticas testadas envolvendo anticorpos marcados com oligonucleotídeos e amplificação quantitativa da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.

O painel de teste incluiu 444 proteínas identificadas em cinco bancos de dados [por exemplo, bancos de dados da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) e Análise de Enriquecimento de Conjunto de Genes (GSEA)]. Depois de comparar, a equipe identificou 135 proteínas relacionadas às plaquetas nos cinco painéis PEA para análise posterior.

Resultados do estudo

A coorte do estudo mostrou maior prevalência de hipertensão arterial, diabetes e doenças inflamatórias crônicas, ateroscleróticas e cardiovasculares em Ei e TVP-EP em comparação com TVi. Os níveis mais elevados de proteína C reativa (PCR), troponina I e peptídeo natriurético tipo B do pró-hormônio N-terminal (NT) (NT-proBNP) refletiram de forma semelhante a maior carga cardiovascular nos subtipos de EP.

Os padrões de prescrição de medicamentos eram correspondentemente diferentes. Por exemplo, os inibidores da agregação plaquetária, ou seja, ácido acetilsalicílico (AAS) e clopidogrel, estavam sobrerrepresentados em pacientes com EP. Uma explicação é que agentes antiplaquetários profiláticos são prescritos em pacientes com EP aguda devido à suspeita de infarto do miocárdio. Também é possível que haja uma diferença na atividade plaquetária entre pacientes com EP e TVi porque a proporção de agentes antiplaquetários é maior nos grupos com PE.

A análise de aprendizado de máquina de 135 proteínas plaquetárias extraídas pelos modelos de regressão logística regulados pelo operador de seleção e encolhimento mínimo absoluto (LASSO) selecionou 24% e 22% para iPE e DVT-PE, respectivamente, refletindo diferentes perfis de proteínas em comparação com iDVT. Notavelmente, todas as 135 proteínas plaquetárias mostraram boa associação com seis marcadores de ativação plaquetária, apoiando a sua provável origem plaquetária no plasma de pacientes com EP aguda em comparação com pacientes com TVi, analisados ​​através dos painéis PEA. Em contraste com a iPE, o fator 1alfa derivado de células estromais (SDF-1α) foi mais altamente expresso em pacientes com TVP-PE do que em pacientes com TVi, sugerindo um possível papel especial na inflamação vascular e na aterogênese.

No iPE, em comparação com o iDVT, a análise da rede de interação proteína-proteína (PPI) resultou em quatro grupos de até seis proteínas que interagem funcionalmente com base em 22 proteínas relacionadas às plaquetas expressas especificamente. O cluster principal estava associado à cola, reconhecimento de padrões e sinalização de receptores imunológicos. Estes incluíram as quinases da família Src (SFK) c-Src, que transmitem sinais de ligantes através dos receptores plaquetários associados ao motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) (por exemplo, glicoproteína VI [GPVI]).

Comparado ao iPE, o DVT-PE apresentou um agrupamento de nove proteínas plasmáticas de interação direta associadas a plaquetas envolvidas na remodelação tecidual e no tráfego de leucócitos. Os inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz 1 (TIMP1) e TIMP4, importantes efetores da remodelação tecidual, foram mais altamente expressos na TVP-PE do que na TVi e foram secretados pelos grânulos α das plaquetas.

Os autores descobriram que níveis plasmáticos mais elevados de ambos os inibidores teciduais de TIMP1 e TIMP4 estavam associados a diabetes tipo 2, hipertensão arterial e infarto do miocárdio, consistente com a maior prevalência de eventos cardiovasculares maiores na TVP-EP em comparação com TVi.

Conclusões

Os resultados do presente estudo mostraram que ambos os subtipos de PE apresentavam perfis específicos de proteínas plasmáticas associados às plaquetas. Por exemplo, o estudo distinguiu uma expressão mais elevada de P-selectina no plasma de pacientes com TVP-EP em comparação com TVi, sugerindo uma associação com a gravidade da doença TVP. Curiosamente, a altura do pico da trombina e a agregação plaquetária espontânea no plasma rico em plaquetas foram negativamente associadas na EPi em comparação com o fenótipo da TVPi. Estes resultados sugerem que a menor reatividade plaquetária in vitro pode estar associada a uma maior ativação plaquetária in vivo durante a fase aguda da EP em comparação com a TVID. Mais importante ainda, estes resultados sugerem que, embora os subtipos de PE compartilhem alguns pontos em comum, eles também exibem padrões distintos de ativação plaquetária.

Este estudo não abordou a quantificação e caracterização de EV no plasma de fenótipos de TEV. Em pacientes com câncer, o TEV pode estar associado ao aumento dos níveis plasmáticos de micropartículas. No entanto, um aumento significativo de micropartículas derivadas de plaquetas só foi observado em TEV recorrente em pacientes não oncológicos em comparação com doadores de sangue saudáveis. Estudos futuros deverão esclarecer a distribuição do VE nos diferentes fenótipos de TEV. Mais estudos também são necessários para especificar a influência de diferentes tipos de células na liberação de proteínas derivadas de plaquetas na PE.

Em resumo, os dados do estudo sugeriram que o iPE e o TVP-PE tinham assinaturas plasmáticas específicas, mas diferentes, envolvidas na trombose imune relacionada às plaquetas e nos processos tromboinflamatórios em comparação com o iDVT. Além disso, os perfis de proteínas de ativação plaquetária pareciam diferir entre os subtipos de PE, com predominância de proteínas secretadas na TVP-PE em comparação com proteínas que têm maior probabilidade de serem liberadas no plasma por EV na iPE. No geral, as plaquetas contribuem para a regulação de diferentes níveis de proteínas plasmáticas na fase aguda da EP, que variam dependendo do subtipo de EP.

Referência:

• Gaukhar Baidildinova, Vincent ten Cate, Markus Nagler, et al. (2022). Subtypspezifische Plasmasignaturen der thrombozytenbezogenen Proteinfreisetzung bei akuter Lungenembolie. Thromboseforschung. doi: https://doi.org/10.1016/j.thromres.2022.10.005 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0049384822004157

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