Vyšetrenie plazmatických podpisov proteínov odvodených od krvných doštičiek pri akútnej pľúcnej embólii

Vyšetrenie plazmatických podpisov proteínov odvodených od krvných doštičiek pri akútnej pľúcnej embólii

V nedávnej štúdii publikovanej v Výskum trombózy výskumníci určili plazmatické signatúry proteínov súvisiacich s krvnými doštičkami alebo odvodených proteínov pri akútnej izolovanej pľúcnej embólii (iPE) a PE spojenej s hlbokou žilovou trombózou (DVT-PE) v porovnaní s izolovanou DVT (iDVT).

Lernen: Subtypspezifische Plasmasignaturen der thrombozytenbezogenen Proteinfreisetzung bei akuter Lungenembolie. Bildquelle: Victor Josan/Shutterstock

pozadia

Dva primárne podtypy PE sú iPE a DVT-PE a štúdie ukázali, že profily plazmatických proteínov sa pri týchto dvoch ochoreniach líšia. Krvné doštičky pôsobia ako bunkové linkery a uľahčujú zápalové presluchy medzi imunitnými a endotelovými bunkami počas vysokého arteriálneho šmykového stresu. Tento proces zahŕňa priamu interakciu sprostredkovanú receptorom medzi prozápalovými molekulami a extracelulárnymi vezikulami (EV). Avšak lokálne zápalové reakcie v endoteli pri nízkom šmykovom napätí aktivujú krvné doštičky, aby spustili rozvoj venózneho tromboembolizmu (VTE) a jeho podtypov, vrátane PE a DVT. Mechanizmy, ktoré riadia tento proces, sú menej známe.

Experimentálne údaje naznačujú, že krvné doštičky prispievajú k trombozápalu v žilovom systéme spúšťaním zápalových a koagulačných procesov. Napríklad pomocou myšacieho modelu VTE výskumníci ukázali, že krvné doštičky interagujú s endotelovými bunkami vystavenými von Willebrandovmu faktoru (VWF) a vytvárajú konjugáty s leukocytmi prostredníctvom glykoproteínu (GP) Iba, ako aj spúšťajú nábor endotelu a koaguláciu závislú od leukocytov.

Experimenty na ľuďoch preukázali rôzne charakteristiky aktivácie a reaktivity krvných doštičiek pri akútnej VTE. Napríklad krvné doštičky od pacientov s akútnym VTE vykazovali väčšiu exocytózu hustých granúl a lyzozómov. Súviselo to s vyššími plazmatickými hladinami tromboxánu B2, ale nižšou tvorbou trombínu závislou od krvných doštičiek ako u pacientov s vylúčenou VTE, bez ohľadu na liečbu aspirínom.

Štúdie hmotnostnej spektrometrie (MS) detegovali viac ako 3700 proteínov v pokojových, inhibovaných a aktivovaných vysoko purifikovaných ľudských krvných doštičkách. Pokročilé testy založené na ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) využívajúce MS by mohli umožniť kvalitatívne hodnotenie proteínov uvoľňujúcich krvné doštičky v plazme a izolovaných krvných doštičkách. Chýba však podrobnejšia analýza plazmatických proteínov spojených s krvnými doštičkami vo veľkých kohortách VTE.

O štúdiu

V súčasnej multicentrickej prospektívnej kohortovej štúdii výskumníci skúmali plazmu od 541 pacientov s VTE pomocou analýzy založenej na strojovom učení. Cieľom bolo identifikovať plazmatické proteíny pre domnelé uvoľňovanie krvných doštičiek špecifické pre iPE a DVT-PE. Títo pacienti mali akútnu VTE v čase prijatia, ako bolo diagnostikované zobrazovaním. Zatiaľ čo tam bolo 99 pacientov s iPE, 282 bolo pacientov s DVT-PE a tím porovnal svoje údaje s údajmi 160 pacientov s iDVT. Tím použil farebný dopplerovský ultrazvuk na celej nohe a počítačovú tomografiu (CT) pľúcnu angiografiu na diagnostiku DVT a PE. Angiológovia a rádiológovia s certifikáciou rady posudzovali a overovali všetky diagnózy štúdie.

Zozbierali študijné vzorky v rámci projektu Genotyping and Molecular Fenotyping of Venous Tromboembolism (GMP-VTE) realizovaného v Nemecku. Výskumníci použili technológiu proximitného predlžovacieho testu (PEA) na profilovanie vysokého a nízkeho plazmatického proteínu zo vzoriek skladovaných pri -80 °C. PEA určila normalizované hodnoty expresie (NPX) pre všetky testované plazmatické proteíny zahŕňajúce protilátky značené oligonukleotidmi a kvantitatívnu amplifikáciu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase.

Testovací panel zahŕňal 444 proteínov identifikovaných z piatich databáz [napr. databázy Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)]. Po porovnaní tím nakoniec identifikoval 135 proteínov súvisiacich s krvnými doštičkami v piatich paneloch PEA na ďalšiu analýzu.

Výsledky štúdie

Štúdia preukázala vyššiu prevalenciu arteriálnej hypertenzie, cukrovky a chronických zápalových, aterosklerotických a kardiovaskulárnych ochorení pri iPE a DVT-PE v porovnaní s iDVT. Vyššie hladiny C-reaktívneho proteínu (CRP), troponínu I a N-terminálneho (NT) prohormónu natriuretického peptidu typu B (NT-proBNP) podobne odrážali väčšiu kardiovaskulárnu záťaž v podtypoch PE.

Vzory predpisovania liekov boli zodpovedajúcim spôsobom odlišné. Napríklad u pacientov s PE boli nadmerne zastúpené inhibítory agregácie krvných doštičiek, t.j. kyselina acetylsalicylová (ASA) a klopidogrel. Jedným z vysvetlení je, že profylaktické protidoštičkové látky sa predpisujú pacientom s akútnou PE v dôsledku podozrenia na infarkt myokardu. Je tiež možné, že medzi pacientmi s PE a pacientmi s iDVT existuje rozdiel v aktivite krvných doštičiek, pretože podiel protidoštičkových látok je vyšší v skupinách s PE.

Analýza strojového učenia 135 extrahovaných proteínov krvných doštičiek pomocou logistických regresných modelov regulovaných operátorom najmenšieho absolútneho zmršťovania a selekcie (LASSO) vybrala 24 % a 22 % pre iPE a DVT-PE, v uvedenom poradí, čo odráža odlišné proteínové profily v porovnaní s iDVT. Je pozoruhodné, že všetkých 135 proteínov krvných doštičiek vykazovalo dobrú asociáciu so šiestimi markermi aktivácie krvných doštičiek, čo podporuje ich pravdepodobný pôvod krvných doštičiek v plazme pacientov s akútnou PE v porovnaní s pacientmi s iDVT, analyzovanými prostredníctvom panelov PEA. Na rozdiel od iPE bol faktor 1alfa (SDF-1α) odvodený od stromálnych buniek viac exprimovaný v DVT-PE ako u pacientov s iDVT, čo naznačuje možnú špeciálnu úlohu pri vaskulárnom zápale a aterogenéze.

V iPE v porovnaní s iDVT viedla analýza siete interakcie proteín-proteín (PPI) k štyrom zhlukom až šiestich funkčne interagujúcich proteínov na základe 22 špecificky exprimovaných proteínov súvisiacich s krvnými doštičkami. Hlavný klaster bol spojený s lepidlom, rozpoznávaním vzorov a signalizáciou imunitných receptorov. Patria sem kinázy rodiny Src (SFK) c-Src, ktoré prenášajú ligandové signály prostredníctvom doštičkových receptorov spojených s aktivačným motívom na báze tyrozínu (ITAM) (napr. glykoproteín VI [GPVI]).

V porovnaní s iPE predstavoval DVT-PE zhluk deviatich priamo interagujúcich plazmatických proteínov spojených s krvnými doštičkami zapojenými do prestavby tkaniva a prenosu leukocytov. Tkanivové inhibítory matricových metaloproteináz 1 (TIMP1) a TIMP4, dôležité efektory tkanivovej remodelácie, boli viac exprimované v DVT-PE ako v iDVT a boli vylučované z a-granúl krvných doštičiek.

Autori zistili, že vyššie plazmatické hladiny oboch tkanivových inhibítorov TIMP1 a TIMP4 boli spojené s diabetom 2. typu, arteriálnou hypertenziou a infarktom myokardu, čo je v súlade s vyššou prevalenciou veľkých kardiovaskulárnych príhod pri DVT-PE v porovnaní s iDVT.

Závery

Výsledky súčasnej štúdie ukázali, že oba podtypy PE mali špecifické profily plazmatických proteínov spojené s krvnými doštičkami. Štúdia napríklad rozlíšila vyššiu expresiu P-selektínu v plazme pacientov s DVT-PE v porovnaní s iDVT, čo naznačuje súvislosť so závažnosťou ochorenia DVT. Je zaujímavé, že výška vrcholu trombínu a spontánna agregácia krvných doštičiek v plazme bohatej na krvné doštičky boli negatívne spojené s iPE v porovnaní s fenotypom iDVT. Tieto výsledky naznačujú, že nižšia reaktivita krvných doštičiek in vitro môže byť spojená s vyššou aktiváciou krvných doštičiek in vivo počas akútnej fázy PE v porovnaní s iDVT. Čo je dôležitejšie, tieto výsledky naznačujú, že zatiaľ čo podtypy PE zdieľajú niektoré spoločné znaky, vykazujú tiež odlišné vzorce aktivácie krvných doštičiek.

Táto štúdia sa nezaoberala kvantifikáciou a charakterizáciou EV v plazme fenotypov VTE. U pacientov s rakovinou môže byť VTE spojená so zvýšenými plazmatickými hladinami mikročastíc. Významné zvýšenie mikročastíc pochádzajúcich z krvných doštičiek sa však pozorovalo len pri rekurentnej VTE u pacientov bez rakoviny v porovnaní so zdravými darcami krvi. Budúce štúdie by mali objasniť distribúciu EV v rôznych fenotypoch VTE. Ďalšie štúdie sú potrebné aj na špecifikáciu vplyvu rôznych typov buniek na uvoľňovanie proteínov odvodených od krvných doštičiek v PE.

Stručne povedané, údaje zo štúdie naznačujú, že iPE a DVT-PE mali špecifické, ale odlišné plazmatické podpisy zapojené do imunitnej trombózy súvisiacej s krvnými doštičkami a trombozápalových procesov v porovnaní s iDVT. Okrem toho sa zdá, že profily proteínov aktivácie krvných doštičiek sa medzi podtypmi PE líšia, s prevahou vylučovaných proteínov v DVT-PE v porovnaní s proteínmi, ktoré sa pravdepodobnejšie uvoľňujú do plazmy prostredníctvom EV v iPE. Celkovo sa krvné doštičky podieľajú na regulácii rôznych hladín plazmatických proteínov v akútnej fáze PE, ktoré sa líšia v závislosti od podtypu PE.

Referencia:

• Gaukhar Baidildinova, Vincent ten Cate, Markus Nagler, et al. (2022). Subtypspezifische Plasmasignaturen der thrombozytenbezogenen Proteinfreisetzung bei akuter Lungenembolie. Thromboseforschung. doi: https://doi.org/10.1016/j.thromres.2022.10.005 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0049384822004157

.