Un campionatore d'aria portatile per quantificare e rilevare gli aerosol SARS-CoV-2 nei laboratori

Un campionatore d'aria portatile per quantificare e rilevare gli aerosol SARS-CoV-2 nei laboratori

In un recente studio pubblicato su bioRxiv *Ricercatori nel Regno Unito hanno valutato un campionatore d’aria portatile alimentato a batteria che potrebbe recuperare la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) aerosolizzata in un laboratorio utilizzando un test sulla placca.

Studio: Un metodo ottimizzato per il recupero e la quantificazione degli aerosol SARS-CoV-2 generati in laboratorio mediante il test delle placche. Credito immagine: ktsdesign / Shutterstock

*NOTA importante:bioRxiv pubblica rapporti scientifici preliminari che non sono sottoposti a revisione paritaria e pertanto non devono essere considerati conclusivi, intesi a guidare la pratica clinica/comportamento relativo alla salute o trattati come informazioni consolidate.

sfondo

I ricercatori continuano a dibattere sul rischio percepito derivante dall’aerosol dell’acido ribonucleico (RNA) SARS-CoV-2 vitale sin dalla sua comparsa alla fine del 2019. In assenza di dati affidabili sull’isolamento del virus, un’analisi retrospettiva degli eventi di superdiffusione è l’unico modo per credere che questo virus venga trasmesso tramite aerosol. Ad esempio, l’aria nelle stanze d’ospedale potrebbe aver aerosolizzato il SARS-CoV-2. Tuttavia, gli studi non hanno dimostrato il recupero e la quantificazione del SARS-CoV-2 aerosolizzato con potenziale infettivo.

Sviluppare un metodo affidabile per rilevare la SARS-CoV-2 dall’aria è rimasta una sfida sperimentale. I test citopatici rivelano la presenza di virus infettivi; Tuttavia, i risultati sono soggettivi. Spesso si affidano all'esperienza di un tecnico per rilevare i cambiamenti nella morfologia cellulare dovuti all'infezione dei virus. Ciò rende i test sulle placche il gold standard per quantificare i virus infettivi. Il numero di singole placche nella coltura cellulare indica il titolo virale dell'inoculo nei test sulle placche.

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori hanno prima nebulizzato SARS-CoV-2 (variante Delta) a una concentrazione stock di 1,4 x 105 unità formanti placca (PFU)/mL in una cabina di sicurezza microbiologica di classe II (MBSC) utilizzando un nebulizzatore con modulo di atomizzazione bluestone (BLAM).

Per ciascuna condizione di studio, hanno generato aerosol a una velocità di 18 litri al minuto (L/min) per quattro minuti. Un aeroporto MD8 con membrane di gelatina ha recuperato l’RNA del SARS-CoV-2 a una velocità di 30 l/minuto (50 litri in totale). Il metodo si basava sul movimento meccanico della membrana e sull'aggiunta di sostanze chimiche.

Il team ha testato numerose variabili durante lo sviluppo del protocollo di studio. Hanno inoltre condotto tre repliche biologiche per ciascuna variabile testata. Nel complesso, hanno condotto questo esperimento in tre fasi.

Nella Fase I, il team ha determinato se l'esperimento richiedeva il passaggio nelle cellule (fase di arricchimento) prima della placcatura. Inoltre, hanno determinato il momento ottimale per sciogliere le membrane di gelatina. Il tempo ottimale per sciogliere le membrane di gelatina era compreso tra un'ora, quattro ore e 24 ore. Infine, per ciascun campione, hanno esaminato le condizioni di conservazione temporanea delle membrane disciolte nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM). È la variabile di studio primaria che determina la viscosità delle membrane di gelatina sospese, che a sua volta influenza l'accurato pipettaggio della sospensione. Le condizioni di conservazione variavano dalla temperatura ambiente (RT) a 4°C e −20°C.

Nella Fase II, il team ha testato le quantità di DMEM (5 ml, 10 ml o 20 ml) necessarie per sospendere la membrana di gelatina dopo aver catturato l'aerosol. Hanno inoltre considerato il volume del campione richiesto per infettare le cellule (100 µL o 200 µL). Nella Fase III, il team ha misurato gli effetti del congelamento delle membrane di gelatina subito dopo il recupero del virus. Li ha aiutati a valutare l'elaborazione dei campioni come conveniente per il personale di laboratorio.

Risultati dello studio

Un singolo passaggio nelle cellule ha aumentato il recupero di SARS-CoV-2 con il metodo di studio, sebbene il congelamento delle membrane prima della sospensione nei terreni di coltura abbia ridotto il recupero. Sulla base dei dati dello studio, gli autori raccomandano che i campioni vengano elaborati immediatamente dopo la raccolta. Sfortunatamente, la necessità del passaggio cellulare limitava la quantificazione diretta dei titoli virali originariamente determinati durante il campionamento dell’aria. Sebbene in piccole quantità, il metodo di analisi è stato in grado di recuperare SARS-CoV-2 attraverso il passaggio cellulare prima del test sulla placca.

Conclusioni

Gli autori non sono stati in grado di chiarire se il metodo di studio dovesse essere ottimizzato separatamente per ciascuna variante problematica di SARS-CoV-2 (VOC). Pertanto, hanno raccomandato di valutare tutte le tecnologie cellulari per i nuovi COV per fornire un quadro per l'ottimizzazione.

Gli aerosol prodotti in laboratorio non possono riprodurre tutte le dimensioni delle particelle negli aerosol derivati ​​dal linguaggio umano. Inoltre, anche il BLAM utilizzato nello studio non è riuscito a riprodurre la composizione degli aerosol virali prodotti dall’espirazione umana. Inoltre, gli aerosol generati dall’uomo variano da persona a persona a seconda della gravità della malattia. Tuttavia, i risultati dello studio attuale potrebbero essere utili per ulteriori ricerche sulla trasmissione della SARS-CoV-2 e contribuire allo sviluppo di metodi di campionamento ambientale.

*NOTA importante:bioRxiv pubblica rapporti scientifici preliminari che non sono sottoposti a revisione paritaria e pertanto non devono essere considerati conclusivi, intesi a guidare la pratica clinica/comportamento relativo alla salute o trattati come informazioni consolidate.

Riferimento:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Eine optimierte Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von im Labor erzeugten SARS-CoV-2-Aerosolen durch Plaque-Assay, Rachel L. Byrne, Susan Gould, Thomas Edwards, Dominic Wooding, Barry Atkinson, Ginny Moore, Kieran Collings, Cedric Boisdon, Simon Maher, Giancarlo Biagini , Emily R. Adams, Tom Fletcher, Shaun H. Pennington, bioRxiv-Vorabdruck 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.31.514483, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.31.514483v1