Przenośny próbnik powietrza do ilościowego oznaczania i wykrywania aerozoli SARS-CoV-2 w laboratoriach

Przenośny próbnik powietrza do ilościowego oznaczania i wykrywania aerozoli SARS-CoV-2 w laboratoriach

W niedawnym badaniu opublikowanym w bioRxiv *Naukowcy z Wielkiej Brytanii ocenili przenośny próbnik powietrza zasilany bateryjnie, który może wykryć w laboratorium koronawirus 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2) w postaci aerozolu przy użyciu testu łysinkowego.

Badanie: Zoptymalizowana metoda odzyskiwania i oznaczania ilościowego wytworzonych w laboratorium aerozoli SARS-CoV-2 przy użyciu testu łysinkowego. Źródło obrazu: ktsdesign / Shutterstock

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

tło

Naukowcy w dalszym ciągu debatują na temat postrzeganego ryzyka związanego z aerozolowaniem żywotnego kwasu rybonukleinowego (RNA) SARS-CoV-2 od czasu jego pojawienia się pod koniec 2019 r. Wobec braku wiarygodnych danych dotyczących izolacji wirusa retrospektywna analiza zdarzeń związanych z superrozprzestrzenianiem jest jedynym sposobem, aby uwierzyć, że wirus ten jest przenoszony przez aerozole. Na przykład powietrze w salach szpitalnych mogło zawierać aerozol SARS-CoV-2. Badania nie wykazały jednak odzyskiwania i oznaczania ilościowego SARS-CoV-2 w postaci aerozolu o potencjale zakaźnym.

Wyzwaniem eksperymentalnym pozostawało opracowanie niezawodnej metody wykrywania SARS-CoV-2 w powietrzu. Testy cytopatyczne ujawniają obecność zakaźnych wirusów; Jednak Twoje wyniki są subiektywne. Często polegają na wiedzy technika, aby wykryć zmiany w morfologii komórek spowodowane infekcją wirusów. To sprawia, że ​​testy łysinkowe stanowią złoty standard w ilościowej ocenie wirusów zakaźnych. Liczba pojedynczych łysinek w hodowli komórkowej wskazuje na miano wirusa w inokulum w teście łysinkowym.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy najpierw nebulizowali SARS-CoV-2 (wariant Delta) przy stężeniu podstawowym 1,4 x 105 jednostek tworzących łysinki (PFU)/ml w szafie bezpieczeństwa mikrobiologicznego (MBSC) klasy II przy użyciu nebulizatora z modułem atomizacji bluestone (BLAM).

Dla każdego warunku badania generowali aerozole z szybkością 18 litrów na minutę (l/min) przez cztery minuty. Lotnisko MD8 wyposażone w membrany żelatynowe odzyskiwało RNA SARS-CoV-2 z szybkością 30 l/min (łącznie 50 litrów). Metoda opierała się na mechanicznym ruchu membrany i dodatku środków chemicznych.

Podczas opracowywania protokołu badania zespół przetestował wiele zmiennych. Przeprowadzili także trzy repliki biologiczne dla każdej testowanej zmiennej. Ogólnie rzecz biorąc, przeprowadzili ten eksperyment w trzech fazach.

W fazie I zespół ustalił, czy eksperyment wymaga przejścia do komórek (etap wzbogacania) przed osadzeniem na płytkach. Ponadto określili optymalny czas rozpuszczania membran żelatynowych. Optymalny czas rozpuszczania membran żelatynowych wynosił od jednej godziny, czterech godzin do 24 godzin. Na koniec dla każdej próbki zbadano warunki tymczasowego przechowywania rozpuszczonych membran w pożywce Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM). Jest to główna zmienna badawcza, która określa lepkość zawieszonych membran żelatynowych, co z kolei wpływa na dokładność pipetowania zawiesiny. Warunki przechowywania wahały się od temperatury pokojowej (RT) do 4°C i -20°C.

W fazie II zespół przetestował ilości DMEM (5 ml, 10 ml lub 20 ml) wymagane do zawieszenia membrany żelatynowej po wychwyceniu aerozolu. Uwzględniono także objętość próbki wymaganą do zainfekowania komórek (100 µl lub 200 µl). W fazie III zespół zmierzył skutki zamrożenia membran żelatynowych wkrótce po odzyskaniu wirusa. Pomogło im to ocenić, czy przetwarzanie próbek jest wygodne dla personelu laboratorium.

Wyniki badań

Pojedyncze pasażowanie komórek zwiększyło odzysk SARS-CoV-2 według metody badawczej, chociaż zamrożenie membran przed zawieszeniem w pożywce hodowlanej zmniejszało odzysk. Na podstawie danych z badań autorzy zalecają przetwarzanie próbek bezpośrednio po pobraniu. Niestety wymóg pasażu komórek ograniczył bezpośrednie oznaczenie ilościowe mian wirusa pierwotnie określonych podczas pobierania próbek powietrza. Chociaż w małych ilościach, metodą testową udało się odzyskać SARS-CoV-2 poprzez pasaż komórkowy przed testem łysinkowym.

Wnioski

Autorzy nie byli w stanie wyjaśnić, czy metodę badania należy optymalizować oddzielnie dla każdego budzącego obawy wariantu SARS-CoV-2 (VOC). Dlatego zalecili ocenę wszystkich technologii ogniw pod kątem nowych LZO, aby zapewnić ramy optymalizacji.

Aerozole wytwarzane w laboratorium nie są w stanie odtworzyć wszystkich rozmiarów cząstek aerozoli pochodzących z ludzkiej mowy. Ponadto zastosowany w badaniu BLAM również nie odtworzył składu aerozoli wirusowych wytwarzanych przez ludzkie wydychanie. Ponadto aerozole wytwarzane przez człowieka różnią się w zależności od osoby, w zależności od ciężkości choroby. Niemniej jednak wyniki obecnych badań mogą być pomocne w dalszych badaniach nad transmisją SARS-CoV-2 i przyczynić się do rozwoju metod pobierania próbek środowiskowych.

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Eine optimierte Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von im Labor erzeugten SARS-CoV-2-Aerosolen durch Plaque-Assay, Rachel L. Byrne, Susan Gould, Thomas Edwards, Dominic Wooding, Barry Atkinson, Ginny Moore, Kieran Collings, Cedric Boisdon, Simon Maher, Giancarlo Biagini , Emily R. Adams, Tom Fletcher, Shaun H. Pennington, bioRxiv-Vorabdruck 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.31.514483, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.31.514483v1