Analizy metagenomiczne DNA próbek klinicznych od osób zakażonych wirusem ospy małpiej

Analizy metagenomiczne DNA próbek klinicznych od osób zakażonych wirusem ospy małpiej

W niedawnym badaniu opublikowanym w bioRxiv * Naukowcy przeanalizowali sekwencje genomu wirusa ospy małpiej (MPXV) uzyskane od 18 pacjentów, którzy nabyli zakażenie MPXV w okresie od czerwca do lipca 2022 r.

Studie: Die Sequenzierung des Monkeypox-Virus infizierter Patienten zeigt virale Genome mit APOBEC3-ähnlicher Bearbeitung, Geninaktivierung und bakteriellen Erregern der Hautsuperinfektion. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

tło

MPXV ma genom dwuniciowego kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) i należy do rodziny wirusów Poxviridae i rodzaju Orthopoxviruses. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała trzy grupy wirusów, nazwane od jednej do trzech, które obejmują wirusy, które pojawiły się podczas epidemii w latach 2017–2018 (Nigeria) oraz wirusy powiązane z obecną ponadnarodową epidemią w 2022 r.

Od 2022 r. wszystkie zakażenia ludzkim MPXV importowane z Afryki Subsaharyjskiej występowały sporadycznie w krajach nieendemicznych. Poprzednie badania filogenetyczne oparte na genomach MPXV opublikowane w Portugalii i Francji w 2022 r. wykazały, że wirusy te należą do grupy III i prawdopodobnie mają jedno pochodzenie. Charakterystyka epidemiologiczna i kliniczna obecnej epidemii również sugeruje, że jest ona przenoszona drogą płciową.

Ponadto wirusy te obejmują linię zwaną B.1, która pojawiła się w Europie między listopadem 2021 r. a majem 2022 r. Linia B.1 oddzieliła się od swojej przodkowej linii A.1 o około 50 podstawień nukleotydów, prawie dziesięciokrotnie więcej niż oczekiwano.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy wykorzystali technologie sekwencjonowania genomu Illumina i Nanopore (NGS) nowej generacji do przeprowadzenia analiz metagenomicznych DNA próbek klinicznych od osób zakażonych MPXV. Uzyskali genomy MPXV ze zmian skórnych narządów płciowych i wymazów z odbytu od 18 pacjentów zakażonych MPXV.

Badacze wzięli pod uwagę NGS w przypadku próbek klinicznych z ilościowym progiem cyklu (CT) ilościowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy-polimerazy (qRT-PCR) ≤25. Następnie przeprowadzili analizy metagenomiczne wszystkich serii NGS. Ponadto zmapowali surowe odczyty NGS z numerem dostępu GenBank genomu MPXV. ON563414.3, genom MPXV o długości 197 205 par zasad pobrany z próbki pacjenta w Massachusetts w USA w maju 2022 r. Narzędzie Nextclade w wersji 1.6.0 wykorzystuje te próbki genomu jako genom referencyjny B.1.

Do analiz filogenetycznych zespół uzyskał genomy MPXV, które zdeponowano w bazie danych „Global Initiative on Sharing All Influenza Data” (GISAID) do 22 sierpnia 2022 r. Zidentyfikowali mutacje wspólne dla tych objętych niniejszym badaniem. Dodano numery dostępu GenBank 412 NC_063383 i ON563414 w celu ukorzeniania drzewa filogenetycznego. Krajowa Agencja ds. Bezpieczeństwa Leków i Produktów Opieki Zdrowotnej (ANSM) zatwierdziła NGS genomów MPXV.

Wyniki badań

Naukowcy przebadali 307 pacjentów pod kątem obecności MPXV za pomocą metody qPCR w czasie rzeczywistym na zmianach skórnych oraz próbkach kału i nosogardła w okresie od maja do lipca 2022 r. W szczególności uzyskali 11 próbek zmian skórnych, w tym pięć na prąciu, sześć na odbytnicy i jedną w nosogardzieli.

Średnia liczba surowych odczytów NSG zmapowanych na numer dostępu GenBank genomu. ON563414.3 wynosił 44 615 na próbkę, przy średniej głębokości sekwencjonowania i średnim pokryciu genomu odpowiednio 48 ± 41 odczytów lub 98,0 ± 2,8%. Zespół odkrył, że wszystkie 18 genomów MPXV uzyskanych w niniejszym badaniu należało do linii B.1 grupy III według klasyfikacji WHO, a dwa należały do ​​podlinii B.1.1. W porównaniu z referencyjnym genomem MPXV ON563414.3, sześć z 18 genomów było genetycznie identycznych, podczas gdy 12 miało co najmniej jedną mutację, a średnia identyczność nukleotydów między tymi genomami wynosiła 99,8 ± 0,2%, zgodnie z obliczeniami porównania parami. Te 18 genomów miało średnio 3,3 ± 2,2 mutacji w porównaniu z ON563414.3.

Z łącznej liczby 36 różnych mutacji, które były obecne w co najmniej jednym z 18 genomów, 22 nie były synonimami, a 14 było synonimami. 22 niesynonimiczne mutacje zagnieżdżono w 20 genach rozproszonych wzdłuż genomu MPXV. Te 20 genów zakodowanych –

i) dwie podjednostki polimerazy kwasu rybonukleinowego (RNA);

ii) dwie podjednostki wczesnego czynnika transkrypcyjnego oraz jeden pośredni i jeden późny czynnik transkrypcyjny;

iii) białko podobne do fosfolipazy D; I

iv) cztery białka zawierające powtórzenia ankyrynowe.

Innymi słowy, te niesynonimiczne mutacje spowodowały zmiany aminokwasów w białkach wirusowych, które są krytyczne dla replikacji i morfogenezy wirionu, a także interakcji wirus-gospodarz. Przyszłe badania powinny dokładniej zbadać wpływ tych mutacji na funkcję tych białek i cykl replikacji MPXV.

Inną ważną obserwacją był wyższy współczynnik mutacji niż oczekiwano w przypadku ortopokswirusów na podstawie poprzedniej oceny, co sugeruje, że MPXV może przyspieszyć jego ewolucję. Według autorów większa liczba mutacji pomiędzy 66 a 73 aminokwasami w genomach MPXV w porównaniu z genomem NC_063383.1 uzyskanym z 304 próbek ludzkich pobranych w Nigerii w sierpniu 2018 r. może wynikać z działania rodziny edytującej mRNA apolipoproteiny B na katalityczne enzymy polipeptydopodobne (APOBEC3).

Co ciekawe, badacze odkryli także odczyty NGS, które pozwoliły zidentyfikować sekwencje S. aureus i S. pyogenes w większości próbek klinicznych zmian skórnych wykazujących obecność wirusa MPX. Te dwie bakterie powodują nadkażenia w przypadkach MPXV; Jednakże potrzeba więcej danych, aby ustalić częstość występowania tych dwóch bakterii w związku ze zmianami wywołanymi wirusem MPX.

WHO zaleca jedynie ścisłe monitorowanie zmian skórnych pod kątem nadkażeń związanych z zapaleniem tkanki łącznej lub ropniami. Zalecają także leczenie nadkażenia antybiotykami skutecznymi przeciwko wrażliwym na metycylinę S. aureus i S. pyogenes. Podobnie amerykańskie Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) zalecają leczenie antybiotykami u osób z wtórnymi bakteryjnymi infekcjami skóry. Niemniej jednak nadkażenia bakteryjne zmian skórnych spowodowały znaczną zachorowalność w wybuchu MPXV w 2022 r. Dlatego w takich przypadkach konieczne jest ścisłe monitorowanie w celu terminowego podania antybiotyków.

Wnioski

Badanie podkreśla potrzebę ścisłego monitorowania wielu aspektów ewolucji genetycznej i wzorców mutacji kladów MPXV, które pojawiły się w krajach nieendemicznych wraz z epidemią w 2022 r. i rozprzestrzeniły się na całym świecie. Na przykład badania powinny zbadać rolę strat genów w przenoszeniu i replikacji MPXV oraz rolę enzymów APOBEC3 w zwiększonym współczynniku mutacji obserwowanym w genomach MPXV.

W szczególności ekspresja i aktywność deaminazowa enzymów APOBEC3 zmienia się w różnych infekcjach i nowotworach. Co najważniejsze, oprócz sekwencjonowania i charakteryzowania genomów MPXV, konieczne jest również wykrycie bakteryjnych patogenów nadkażeń skóry.

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Colson, P. et al. (2022) „Die Sequenzierung des Monkeypox-Virus von infizierten Patienten zeigt virale Genome mit APOBEC3-ähnlicher Bearbeitung, Geninaktivierung und bakteriellen Erregern der Hautsuperinfektion.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.09.26.509493. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.26.509493v1