تم العثور على منطقة تحديد التكامل الطويل للغاية H3 للماشية تتفاعل بشكل متقاطع مع فيروسات الساربيك

تم العثور على منطقة تحديد التكامل الطويل للغاية H3 للماشية تتفاعل بشكل متقاطع مع فيروسات الساربيك

وفي دراسة نشرت مؤخرا في مجلة الكيمياء البيولوجية أجرى الباحثون تحليلًا في المختبر لعزل السلاسل الثقيلة البقرية الطويلة جدًا التي أظهرت ارتباطًا بفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) والفيروسات التاجية ذات الصلة (CoVs).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

خلفية

أظهرت الدراسات أن الأجسام المضادة المعادلة على نطاق واسع (Abs) لديها إمكانات هائلة كعلاجات مضادة للفيروسات نظرًا لقدرتها على تحديد الحواتم المحفوظة للغاية والتي نادرًا ما تتحور في متغيرات الفيروس. تمتلك المجموعة الفرعية البقرية Ab منطقة تحديد تكاملية فائقة الطول (CDR)H3، وهي مثالية لتحديد الحواتم الفيروسية المحفوظة؛ ومع ذلك، فإن نشاطها ضد بروتينات sarbecovirus Spike (S) ليس مميزًا بشكل جيد ويتطلب مزيدًا من التحقيق.

حول الدراسة

في دراسة إثبات المبدأ الحالية، يهدف الباحثون إلى عزل السلاسل الثقيلة البقرية الطويلة للغاية والتي يمكن أن ترتبط ببروتينات فيروس الساربيكو S في المختبر.

تم استخدام فحص سطح خلايا الثدييات لفحص مكتبات CDRH3 Ab فائقة الطول. تم تضخيم الإكسونات المتغيرة لخلايا الكريات البيض gDNA (حمض الديوكسي ريبونوكلييك الجينومي) لإنشاء مكتبة من مظلات الأبقار فائقة الطول. تم بعد ذلك إجراء إثراء مناطق CDRH3 فائقة الطول عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) واختيار الحجم لإنشاء مكتبة من CDRH3 فائقة الطول.

بعد ذلك، قام الفريق بإدخال الأمبليكون في شريط pBovShow. لقد فحصت مكتبة البروتين ذات السلسلة الواحدة المتغيرة (scFv) طويلة للغاية لتحديد الارتباط S لـ SARS-CoV-2 عن طريق نقل مكتبة scFv بشكل عابر إلى خلايا 293T وإجراء تحليل FC. لزيادة كفاءة عزل scFv (s) المرتبط بـ S، تم استنساخ المكتبة في ناقلات LV (فيروس lentivirus)، وتم إنشاء جزيئات LV النمطية الكاذبة مع فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) ونقلها في خلايا 293T للحصول على تسلسلات scFv مجمعة لكل خلية.

أظهر ما مجموعه 15 SCCs (استنساخ خلية واحدة) تفاعل S، ثلاثة منها تحتوي على ثلاثة scFvs مع تسلسل نيوكليوتيد متطابق، المعين B9-scFv. لتحديد موقع حلقة B9-scFv، تمت تنقية الوحدات الفرعية S ومجال ربط مستقبلات S1 وS2 وS1 (RBD) لـ SARS-CoV-2 باستخدام تحليل IMAC (تحليل كروماتوجرافيا تقارب المعدن المثبت). للتحقيق في آلية ربط الأجسام المضادة، تم إجراء قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتيريوم (MS).

نتائج

تم عزل حلقة CDRH3 تفاعلية على نطاق واسع وطويلة للغاية من مكتبة السلسلة الثقيلة الساذجة لـ SARS-CoV-2 والتي أظهرت ارتباطًا بـ SARS-CoV-2 RBD، وجميع متغيرات SARS-CoV-2 المثيرة للقلق (VOCs) وSARS-CoV RBD. قامت الحاتمة بتحييد الفيروسات ذات النمط الكاذب لـ SARS-CoV-S، ولكن ليس من خلال المنافسة مع مستقبلات ACE2 (الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2).

بدلاً من ذلك، قامت الحاتمة بتحييد النمط الكاذب لـ SARS-CoV LVs التي كانت متاحة بشكل عابر عبر حركات بروتين S بين المجالات وزعزعة استقرار مجمع prefusion. تم تحديد الحاتمة في شق خفي على السطح الداخلي لـ RBD، وهو موقع يتداخل مع آثار أقدام عدد قليل من الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 مثل S2H97 و7D6/6D6 وFD20.

تم عزل CDRH3 النشط على نطاق واسع من مكتبة تنوع تسلسلية متواضعة، مما يسلط الضوء على الإمكانات الهائلة للنظام البقري كمصدر للحصول على عضلات البطن النشطة على نطاق واسع والتي يمكن أن توفر الحماية ضد الكائنات المسببة للأمراض الجديدة ومتغيراتها الطافرة. يشتمل B9-scFv على 53% من scFvs التي تم الحصول عليها من خلايا 293T المنقولة من LV بعد اختيار ربط بروتين S واحد، والذي زاد إلى 83% عند المزيد من إثراء FC. وأظهرت النتائج أن B9-scFv كان مسؤولاً إلى حد كبير عن النشاط المضاد لـ S في المكتبة.

أظهرت الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن B9-scFv ارتباطًا بـ S وRBD وS1، ولكن ليس بـ S2، مما يشير إلى أن موقع الربط B9-scFv يقع في بقايا الأحماض الأمينية RBD من 319 إلى 591. وكان ارتباط B9-scFv بالخلايا المنقولة بالبروتين S يعتمد على التركيز ومُثرى مقارنةً بعناصر التحكم scFv فائقة الطول.

والجدير بالذكر أن B9-scFv لم يظهر أي تفاعل مع الخلايا غير المنقولة، حتى عند تركيزات خمسة ملم خلال ساعة واحدة، مما يشير بقوة إلى تفاعل S-Ab محدد. تم الحفاظ على الارتباط B9-scFv-S عبر طفرات مثل N501Y وD614G وY453F وE484K وK417N وL452R في المركبات العضوية المتطايرة لـ SARS-CoV-2 مثل Beta وAlpha وDelta وGamma وOmicron وGamma. أشارت النتائج إلى تفاعل متقاطع واسع النطاق بين B9 وscFv.

كان تقارب الارتباط مع RBDs المتغيرة لـ SARS-CoV-2 مشابهًا مقارنةً بالنوع البري (wt) S، مما يدعم ملاحظة ارتباط B9 scFv بحاتمة مستهدفة ومحفوظة للغاية. كان CR3022 scFv وB9 scFv البشريان المستهدفان بالسارس غير متفاعلين نسبيًا مع فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) RBD، مما يشير إلى أن B9 scFv كان محددًا لفيروس السارس.

وقد لوحظ اختلاف طفيف فقط في ارتباط B9-scFv بـ 200 نانومتر و2.0 ميكرومتر من SARS-CoV RBD، مما يشير إلى تقارب الارتباط النانومولي. قام B9-scFv بتحييد جزيئات الجهد المنخفض بشكل شبه كامل (98%) بـ SARS-CoV S (سلالة حضرية) بتركيز 70 ميكروغرام/مل، لكنه لم يظهر مثل هذه التأثيرات عند عيارات SARS-CoV-2 المكافئة. كانت قيمة التركيز المثبط النصف الأقصى (IC50) لتحييد النمط الكاذب لـ SARS-CoV LV بواسطة B9-scFv هي 468 نانومتر.

بشكل عام، سلطت نتائج الدراسة الضوء على إمكانات عضلات البطن البقرية المعبر عنها في المختبر مع CDRH3s فائقة الطول لعزل علاجات جديدة وفعالة على نطاق واسع لمكافحة الكائنات المسببة للأمراض الناشئة ومتغيراتها، بالإضافة إلى تحديد الحواتم الرئيسية لتطوير اللقاحات. دعم الفريق النتائج التي تم نشرها سابقًا والتي تفيد بأن مناطق CDRH3 فائقة الطول تقترن بسلاسل خفيفة Vπ ثابتة نسبيًا لإنشاء قالب scFv يمكن من خلاله استنساخ مكتبات السلاسل الثقيلة فائقة الطول والتعبير عنها.

مرجع:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675