Bylo zjištěno, že ultra dlouhá oblast určující komplementaritu H3 skotu zkříženě reaguje se sarbekoviry

Bylo zjištěno, že ultra dlouhá oblast určující komplementaritu H3 skotu zkříženě reaguje se sarbekoviry

V nedávno publikované studii v Journal of Biological Chemistry Výzkumníci provedli in vitro analýzu k izolaci ultra dlouhých bovinních těžkých řetězců, které vykazovaly vazbu s koronavirem 2 těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoV-2) a souvisejícími koronaviry (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

pozadí

Studie ukázaly, že široce neutralizující protilátky (Abs) mají obrovský potenciál jako antivirová terapeutika díky své schopnosti identifikovat vysoce konzervované epitopy, které jsou zřídka mutovány ve variantách viru. Podskupina hovězích Ab má ultradlouhou oblast určující komplementaritu (CDR)H3, která je ideální pro identifikaci konzervovaných virových epitopů; Jejich aktivita proti sarbecovirus spike (S) proteinům však není dobře charakterizována a vyžaduje další zkoumání.

O studiu

V této studii prokazující princip se výzkumníci zaměřili na izolaci ultra dlouhých bovinních těžkých řetězců, které by se mohly vázat na proteiny sarbekoviru S in vitro.

Screening povrchu savčích buněk byl použit pro screening ultradlouhých CDRH3 Ab knihoven. Variabilní exony gDNA kravských leukocytů (genomová deoxyribonukleová kyselina) byly amplifikovány za účelem vytvoření knihovny ultradlouhých bovinních paratopů. Obohacení ultradlouhých oblastí CDRH3 pak bylo provedeno polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a selekcí velikosti za účelem vytvoření knihovny ultradlouhých CDRH3.

Poté tým vložil amplikony do kazety pBovShow. Zkoumal proteinovou knihovnu ultra-dlouhého jednořetězcového variabilního fragmentu (scFv), aby identifikoval S-vazbu SARS-CoV-2 přechodnou transfekcí scFv knihovny do 293T buněk a provedením FC analýzy. Aby se zvýšila účinnost izolace scFv(s) vázajících S, byla knihovna klonována do LV vektorů (lentivirus) a LV částice pseudotypizované virem vezikulární stomatitidy (VSV) byly vytvořeny a transdukovány v buňkách 293T, aby se získaly kombinované sekvence scFv pro každou buňku.

Celkem 15 SCC (jednobuněčné klony) vykazovalo S-interakci, z nichž tři obsahovaly tři scFv s identickou nukleotidovou sekvencí, označenou B9-scFv. Pro lokalizaci epitopu B9-scFv byly podjednotky S, S1, S2 a S1 receptorová vazebná doména (RBD) SARS-CoV-2 purifikovány pomocí analýzy IMAC (afinitní chromatografie s imobilizovaným kovem). Pro zkoumání mechanismu vazby protilátky byla provedena diferenciální hmotnostní spektrometrie s výměnou vodíku a deuteria (MS).

Výsledky

Široce reaktivní a ultra dlouhý epitop scFv (B9-scFv) CDRH3 byl izolován z naivní knihovny těžkého řetězce SARS-CoV-2, která vykazovala vazbu na SARS-CoV-2 RBD, všechny varianty SARS-CoV-2 vzbuzující obavy (VOC) a SARS-CoV RBD. Epitop neutralizoval pseudotypové viry SARS-CoV-S, ale ne prostřednictvím kompetice s vazbou receptoru ACE2 (angiotenzin konvertující enzym 2).

Epitop spíše neutralizoval pseudotypizované SARS-CoV LV, které byly přechodně dostupné prostřednictvím pohybů proteinu S mezi doménami, a destabilizoval prefuzní komplex. Epitop se lokalizoval do kryptické štěrbiny na vnitřním povrchu RBD, což je místo, které se překrývalo se stopami několika širokých anti-SARS-CoV-2 Ab, jako jsou S2H97, 7D6/6D6 a FD20.

Široce aktivní CDRH3 byla izolována z knihovny skromné ​​sekvenční diverzity, což zdůrazňuje obrovský potenciál hovězího systému jako zdroje pro získání široce aktivních Ab, které mohou poskytnout ochranu proti novým patogenním organismům a jejich mutantním variantám. B9-scFv obsahoval 53 % scFv získaných z LV-transdukovaných 293T buněk po jediné S protein vazebné selekci, která se po dalším obohacení FC zvýšila na 83 %. Výsledky ukázaly, že B9-scFv byl z velké části zodpovědný za anti-S aktivitu v knihovně.

Buňky přechodně exprimující B9-scFv vykazovaly vazbu na S, RBD a S1, ale ne na S2, což naznačuje, že vazebné místo B9-scFv bylo umístěno na aminokyselinovém zbytku 319 až 591 RBD. Vazba B9-scFv na buňky transfekované S proteinem byla závislá na koncentraci a obohacená ve srovnání s ultradlouhými kontrolami scFv.

Je pozoruhodné, že B9-scFv nevykazoval žádnou reaktivitu s netransfekovanými buňkami, dokonce ani při koncentracích 5 mM po dobu jedné hodiny, což silně ukazuje na specifickou interakci S-Ab. Vazba B9-scFv-S byla udržována prostřednictvím mutací, jako jsou N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N a L452R ve VOC SARS-CoV-2, jako jsou Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron a Gamma. Výsledky ukázaly širokou zkříženou reaktivitu mezi B9 a scFv.

Vazebná afinita k variantám RBD SARS-CoV-2 byla srovnatelná ve srovnání s divokým typem (wt) S, což podporuje pozorování vazby scFv B9 na vysoce cílený a konzervovaný epitop. Lidské CR3022 scFv a B9 scFv zaměřené na SARS byly relativně nereaktivní s blízkovýchodním respiračním syndromem CoV (MERS-CoV) RBD, což naznačuje, že B9 scFv byl specifický pro SARS-CoV.

Byl pozorován pouze nepatrný rozdíl ve vazbě B9-scFv na 200 nM a 2,0 μM SARS-CoV RBD, což ukazuje na nanomolární vazebnou afinitu. B9-scFv téměř úplně (98 %) neutralizoval částice LV pseudotypizované SARS-CoV S (kmen Urbani) v koncentraci 70 μg/ml, ale nevykazoval žádné takové účinky při ekvivalentních titrech SARS-CoV-2. Hodnota poloviční maximální inhibiční koncentrace (IC50) pro pseudotypizovanou SARS-CoV LV neutralizaci pomocí B9-scFv byla 468 nM.

Celkově výsledky studie zdůraznily potenciál in vitro exprimovaných hovězích Abs s ultradlouhými CDRH3 izolovat nová a široce účinná terapeutika pro boj s nově se objevujícími patogenními organismy a jejich variantami, stejně jako pro identifikaci primárních epitopů pro vývoj vakcín. Tým podpořil dříve publikovaná zjištění, že ultradlouhé oblasti CDRH3 se párují s relativně neměnnými lehkými řetězci VA za účelem vytvoření templátu scFv, na kterém lze klonovat a exprimovat knihovny ultradlouhých těžkých řetězců.

Odkaz:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675