Leiti, et veiste ülipikk komplementaarsust määrav piirkond H3 ristreageerib sarbekoviirustega

Leiti, et veiste ülipikk komplementaarsust määrav piirkond H3 ristreageerib sarbekoviirustega

Hiljuti avaldatud uuringus Bioloogilise keemia ajakiri Teadlased viisid läbi in vitro analüüsi, et eraldada ülipikad veiste rasked ahelad, mis näitasid seondumist raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) ja sellega seotud koronaviirustega (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

taustal

Uuringud on näidanud, et laialdaselt neutraliseerivatel antikehadel (Abs) on viirusevastaste ravimitena tohutu potentsiaal tänu nende võimele tuvastada väga konserveerunud epitoope, mis on viiruse variantides harva muteerunud. Veise Ab alamhulgal on ülipikk komplementaarsust määrav piirkond (CDR) H3, mis sobib ideaalselt konserveerunud viiruse epitoopide tuvastamiseks; Kuid nende aktiivsus sarbecovirus spike (S) valkude vastu ei ole hästi iseloomustatud ja vajab täiendavat uurimist.

Uuringu kohta

Käesolevas põhimõtet tõendavas uuringus püüdsid teadlased eraldada veiste ülipikad rasked ahelad, mis võiksid in vitro seostuda sarbekoviiruse S valkudega.

Ülipikade CDRH3 Ab raamatukogude skriinimiseks kasutati imetajate rakupinna skriinimist. Lehma leukotsüütide gDNA (genoomne desoksüribonukleiinhape) varieeruvaid eksoneid amplifitseeriti, et luua veise ülipikade paratoopide raamatukogu. Ülipikade CDRH3 piirkondade rikastamine viidi läbi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja suuruse valiku abil, et luua ülipika CDRH3 raamatukogu.

Järgmisena sisestas meeskond amplikonid pBovShow kassetti. Selles uuriti ülipika üheahelalise muutuva fragmendi (scFv) valgu raamatukogu, et tuvastada SARS-CoV-2 S-side, transfekteerides scFv raamatukogu ajutiselt 293T rakkudesse ja viies läbi FC analüüsi. S-siduvate scFv(de) eraldamise tõhususe suurendamiseks klooniti raamatukogu LV vektoritesse (lentiviirus) ning vesikulaarse stomatiidiviirusega (VSV) pseudotüüpitud LV osakesed genereeriti ja transdutseeriti 293T rakkudes, et saada iga raku jaoks kombineeritud scFv järjestused.

Kokku 15 SCC-d (ühe raku kloonid) näitasid S-interaktsiooni, millest kolm sisaldasid kolme identse nukleotiidjärjestusega scFv-d, mida tähistati kui B9-scFv. B9-scFv epitoobi leidmiseks puhastati SARS-CoV-2 S-subühikud, S1, S2 ja S1 retseptorit siduv domeen (RBD), kasutades IMAC (immobiliseeritud metalliafiinsuskromatograafia) analüüsi. Antikehade seondumise mehhanismi uurimiseks viidi läbi diferentsiaalne vesinik-deuteeriumivahetuse massispektromeetria (MS).

Tulemused

Laias laastus reaktiivne ja ülipikk scFv (B9-scFv) CDRH3 epitoop eraldati SARS-CoV-2 naiivsest raske ahela raamatukogust, mis näitas seostumist SARS-CoV-2 RBD, kõigi SARS-CoV-2 probleemsete variantidega (VOC) ja SARS-CoV RBD-ga. Epitoop neutraliseeris SARS-CoV-S pseudotüübiga viirused, kuid mitte konkureerides ACE2 (angiotensiini konverteeriv ensüüm 2) retseptoriga seondumisega.

Pigem neutraliseeris epitoop pseudotüübiga SARS-CoV LV-sid, mis olid ajutiselt kättesaadavad S-valgu domeenidevahelise liikumise kaudu, ja destabiliseeris prefusioonikompleksi. Epitoop lokaliseeriti veekogu sisepinnal asuvas krüptilises pilus, mis kattus mõne laia SARS-CoV-2 vastase Abs-i, nagu S2H97, 7D6/6D6 ja FD20, jalajälgedega.

Laialdaselt aktiivne CDRH3 eraldati tagasihoidlikust järjestuse mitmekesisuse raamatukogust, tuues esile veisesüsteemi tohutu potentsiaali laialdaselt aktiivsete Ab-de saamise allikana, mis võivad pakkuda kaitset uute patogeensete organismide ja nende mutantsete variantide eest. B9-scFv sisaldas 53% LV-transdutseeritud 293T rakkudest saadud scFv-dest pärast üksikut S-valguga seondumise selektsiooni, mis suurenes FC edasisel rikastamisel 83%-ni. Tulemused näitasid, et B9-scFv oli suuresti vastutav S-vastase aktiivsuse eest raamatukogus.

Rakud, mis ekspresseerivad ajutiselt B9-scFv-d, näitasid seondumist S, RBD ja S1-ga, kuid mitte S2-ga, mis näitab, et B9-scFv sidumissait asus RBD aminohappejääkide 319 kuni 591 juures. B9-scFv seondumine S-valguga transfekteeritud rakkudega sõltus kontsentratsioonist kontrollist ja ülipika rikastatud scFv-ga.

Nimelt ei näidanud B9-scFv reaktiivsust transfekteerimata rakkudega isegi kontsentratsioonidel viis mM ühe tunni jooksul, mis viitab tugevalt spetsiifilisele S-Ab interaktsioonile. B9-scFv-S seondumist säilitati mutatsioonide nagu N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N ja L452R kaudu SARS-CoV-2 lenduvates orgaanilistes ühendites, nagu beeta, alfa, delta, gamma, omikron ja gamma. Tulemused näitasid laialdast ristreaktiivsust B9 ja scFv vahel.

Seondumisafiinsus SARS-CoV-2 variantide RBD-dega oli võrreldav metsiktüüpi (wt) S-ga, mis toetab B9 scFv seondumise jälgimist kõrgelt sihitud ja konserveerunud epitoobiga. SARS-i sihtmärgiga inimese CR3022 scFv ja B9 scFv olid suhteliselt vähereaktiivsed Lähis-Ida respiratoorse sündroomi CoV (MERS-CoV) RBD-ga, mis viitab sellele, et B9 scFv oli SARS-CoV-spetsiifiline.

B9-scFv seondumises 200 nM ja 2, 0 µM SARS-CoV RBD-ga täheldati vaid väikest erinevust, mis näitab nanomolaarset seondumisafiinsust. B9-scFv neutraliseeris peaaegu täielikult (98%) LV-osakesed, mis olid pseudotüüpitud SARS-CoV S-ga (Urbani tüvi) kontsentratsioonis 70 μg/ml, kuid samaväärsete SARS-CoV-2 tiitrite korral sellist toimet ei ilmnenud. Poolmaksimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni väärtus (IC50) pseudotüübiga SARS-CoV LV neutraliseerimiseks B9-scFv-ga oli 468 nM.

Üldiselt tõid uuringutulemused esile ülipikkade CDRH3-dega in vitro ekspresseeritud veise Ab-de potentsiaali isoleerida uudseid ja laialdaselt tõhusaid ravimeid, et võidelda esilekerkivate patogeensete organismide ja nende variantidega, samuti tuvastada vaktsiini väljatöötamise peamised epitoobid. Töörühm toetas varem avaldatud leide, et ülipikad CDRH3 piirkonnad paarituvad suhteliselt invariantsete Vλ kergete ahelatega, et luua scFv matriitsi, millel saab kloonida ja ekspresseerida ülipika raske ahela raamatukogusid.

Viide:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675