Utvrđeno je da ultraduga regija H3 koja određuje komplementarnost goveda križno reagira sa sarbekovirusima

Utvrđeno je da ultraduga regija H3 koja određuje komplementarnost goveda križno reagira sa sarbekovirusima

U nedavno objavljenoj studiji u Journal of Biological Chemistry Istraživači su proveli in vitro analizu kako bi izolirali ultraduge goveđe teške lance koji su pokazali vezanje s koronavirusom 2 teškog akutnog respiratornog sindroma (SARS-CoV-2) i srodnim koronavirusima (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

pozadina

Studije su pokazale da široko neutralizirajuća antitijela (Abs) imaju golem potencijal kao antivirusna terapija zbog svoje sposobnosti da identificiraju visoko očuvane epitope koji su rijetko mutirani u varijantama virusa. Podskup goveđih Ab posjeduje ultradugu regiju koja određuje komplementarnost (CDR)H3, koja je idealna za identifikaciju konzerviranih virusnih epitopa; Međutim, njihova aktivnost protiv proteina sarbecovirus spike (S) nije dobro karakterizirana i zahtijeva daljnje istraživanje.

O studiju

U ovoj studiji dokaza principa, istraživači su imali za cilj izolirati ultra-duge goveđe teške lance koji bi se mogli vezati na proteine ​​sarbecovirusa S in vitro.

Probir površine stanica sisavaca korišten je za pregled ultradugih CDRH3 Ab biblioteka. Varijabilni egzoni gDNA kravljih leukocita (genomska deoksiribonukleinska kiselina) umnoženi su da bi se stvorila biblioteka ultradugih goveđih paratopa. Zatim je izvedeno obogaćivanje ultradugih CDRH3 regija lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i odabirom veličine kako bi se stvorila biblioteka ultradugih CDRH3.

Zatim je tim umetnuo amplikone u pBovShow kasetu. Ispitivao je biblioteku proteina ultradugih jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv) kako bi identificirao S-vezu SARS-CoV-2 prolaznom transfekcijom biblioteke scFv u 293T stanice i izvođenjem FC analize. Kako bi se povećala učinkovitost izolacije scFv(s) vezivanja, biblioteka je klonirana u LV vektore (lentivirus), a LV čestice pseudotipizirane s virusom vezikularnog stomatitisa (VSV) su generirane i transducirane u 293T stanicama kako bi se dobile kombinirane scFv sekvence za svaku stanicu.

Ukupno 15 SCC-ova (jednostaničnih klonova) pokazalo je S-interakciju, od kojih su tri sadržavala tri scFv-a s identičnom nukleotidnom sekvencom, označenom kao B9-scFv. Kako bi se locirao epitop B9-scFv, S podjedinice, S1, S2 i S1 receptorska vezna domena (RBD) SARS-CoV-2 pročišćene su analizom IMAC (imobilizirana metalna afinitetna kromatografija). Kako bi se istražio mehanizam vezanja protutijela, provedena je diferencijalna masena spektrometrija (MS) izmjene vodika i deuterija.

Rezultati

Široko reaktivan i ultra-dug scFv (B9-scFv) CDRH3 epitop izoliran je iz biblioteke naivnih teških lanaca SARS-CoV-2 koja je pokazala vezanje na SARS-CoV-2 RBD, sve SARS-CoV-2 varijante koje izazivaju zabrinutost (VOC) i SARS-CoV RBD. Epitop je neutralizirao SARS-CoV-S pseudotipizirane viruse, ali ne kroz kompeticiju s ACE2 (angiotenzin konvertirajućim enzimom 2) vezanjem na receptor.

Umjesto toga, epitop je neutralizirao pseudotipizirane SARS-CoV LV-ove koji su bili prolazno dostupni putem kretanja proteina S između domena i destabilizirali prefuzijski kompleks. Epitop je lokaliziran u kriptičnoj pukotini na unutarnjoj površini RBD-a, mjestu koje se preklapa s otiscima stopala nekoliko širokih anti-SARS-CoV-2 Abs kao što su S2H97, 7D6/6D6 i FD20.

Široko aktivni CDRH3 izoliran je iz skromne biblioteke raznolikosti sekvenci, naglašavajući ogroman potencijal goveđeg sustava kao izvora za dobivanje široko aktivnih Abs koji mogu pružiti zaštitu od novih patogenih organizama i njihovih mutantnih varijanti. B9-scFv sadržavao je 53% scFv-ova dobivenih iz LV-transduciranih 293T stanica nakon odabira vezanja jednog S proteina, koji se povećao na 83% nakon daljnjeg FC obogaćivanja. Rezultati su pokazali da je B9-scFv uvelike odgovoran za anti-S aktivnost u knjižnici.

Stanice koje prolazno eksprimiraju B9-scFv pokazale su vezanje na S, RBD i S1, ali ne i na S2, što ukazuje da je mjesto vezivanja B9-scFv locirano na RBD aminokiselinskom ostatku 319 do 591. Vezanje B9-scFv na stanice transficirane S proteinom bilo je ovisno o koncentraciji i obogaćeno u usporedbi s ultradugim scFv kontrolama.

Značajno je da B9-scFv nije pokazao nikakvu reaktivnost s netransfektiranim stanicama, čak ni pri koncentracijama od pet mM tijekom jednog sata, što snažno ukazuje na specifičnu interakciju S-Ab. Vezanje B9-scFv-S održano je putem mutacija kao što su N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N i L452R u VOC-ovima SARS-CoV-2 kao što su Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron i Gamma. Rezultati su pokazali široku unakrsnu reaktivnost između B9 i scFv.

Afinitet vezanja za RBD varijante SARS-CoV-2 bio je usporediv s divljim tipom (wt) S, podupirući opažanje vezanja B9 scFv na visoko ciljani i očuvani epitop. Ljudski CR3022 scFv i B9 scFv usmjereni na SARS bili su relativno nereaktivni s Bliskoistočnim respiratornim sindromom CoV (MERS-CoV) RBD, što sugerira da je B9 scFv specifičan za SARS-CoV.

Uočena je samo mala razlika u vezivanju B9-scFv na 200 nM i 2,0 μM SARS-CoV RBD, što ukazuje na nanomolarni afinitet vezanja. B9-scFv je gotovo potpuno (98%) neutralizirao LV čestice pseudotipizirane sa SARS-CoV S (Urbani soj) u koncentraciji od 70 μg/ml, ali nije pokazao takve učinke pri ekvivalentnim titrima SARS-CoV-2. Vrijednost polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za neutralizaciju pseudotipiziranog SARS-CoV LV pomoću B9-scFv bila je 468 nM.

Sveukupno, rezultati studije istaknuli su potencijal in vitro izraženih goveđih Abs s ultradugim CDRH3 za izolaciju novih i široko učinkovitih terapeutika za borbu protiv novonastalih patogenih organizama i njihovih varijanti, kao i za identificiranje primarnih epitopa za razvoj cjepiva. Tim je podržao prethodno objavljene nalaze da se ultradugačke regije CDRH3 spajaju s relativno nepromjenjivim lakim lancima Vλ kako bi se stvorio scFv predložak na kojem se biblioteke ultradugih teških lanaca mogu klonirati i eksprimirati.

Referenca:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675