A szarvasmarhák ultrahosszú komplementaritást meghatározó H3 régiója keresztreakciót mutat a sarbecovírusokkal

A szarvasmarhák ultrahosszú komplementaritást meghatározó H3 régiója keresztreakciót mutat a sarbecovírusokkal

Egy nemrég megjelent tanulmányban a Journal of Biological Chemistry A kutatók in vitro analízist végeztek, hogy izolálják az ultrahosszú szarvasmarha-nehézláncokat, amelyek kötődtek a súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2-höz (SARS-CoV-2) és a rokon koronavírusokhoz (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

háttér

Tanulmányok kimutatták, hogy a széles körben semlegesítő antitestek (Abs) óriási potenciállal bírnak vírusellenes terápiákként, mivel képesek azonosítani a vírusváltozatokban ritkán mutált, erősen konzervált epitópokat. A szarvasmarha Ab alcsoportja ultrahosszú komplementaritást meghatározó régióval (CDR)H3 rendelkezik, amely ideális a konzervált vírusepitópok azonosítására; A sarbecovirus spike (S) fehérjékkel szembeni aktivitásuk azonban nem jól jellemezhető, és további vizsgálatokat igényel.

A tanulmányról

A jelen alapelveket igazoló tanulmányban a kutatók olyan ultrahosszú szarvasmarha-nehézláncok izolálását tűzték ki célul, amelyek in vitro kötődhetnek a sarbecovírus S fehérjéihez.

Az ultrahosszú CDRH3 Ab könyvtárak szűrésére emlős sejtfelszíni szűrést alkalmaztunk. A tehénleukocita gDNS (genomi dezoxiribonukleinsav) változó exonjait amplifikáltuk, hogy ultrahosszú szarvasmarha-paratópok könyvtárát hozzuk létre. Az ultrahosszú CDRH3 régiók dúsítását ezután polimeráz láncreakcióval (PCR) és méretválasztással végeztük, hogy létrehozzuk az ultrahosszú CDRH3-ak könyvtárát.

Ezután a csapat behelyezte az amplikonokat a pBovShow kazettába. Megvizsgálta az ultra-hosszú egyláncú variábilis fragmens (scFv) fehérjekönyvtárat, hogy azonosítsa a SARS-CoV-2 S-kötését oly módon, hogy az scFv-könyvtárat átmenetileg transzfektálta a 293T-sejtekbe, és FC-analízist végzett. Az S-kötő scFv(ek) izolálásának hatékonyságának növelése érdekében a könyvtárat LV-vektorokba (lentivírus) klónozták, és vezikuláris szájgyulladás vírussal (VSV) pszeudotipizált LV-részecskéket generáltak és transzdukáltak a 293T-sejtekben, hogy egyesített scFv-szekvenciákat kapjunk minden egyes sejthez.

Összesen 15 SCC (egysejtes klón) mutatott S-kölcsönhatást, amelyek közül három három, azonos nukleotidszekvenciájú scFv-t tartalmazott, amelyeket B9-scFv-nek neveztek. A B9-scFv epitópjának lokalizálásához a SARS-CoV-2 S alegységeit, S1, S2 és S1 receptorkötő doménjét (RBD) IMAC (immobilizált fémaffinitás kromatográfia) analízissel tisztítottuk. Az antitestkötés mechanizmusának vizsgálatára differenciális hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometriát (MS) végeztünk.

Eredmények

Egy széles körben reaktív és egy ultrahosszú scFv (B9-scFv) CDRH3 epitópot izoláltak egy SARS-CoV-2 naiv nehézlánc-könyvtárból, amely kötődést mutatott a SARS-CoV-2 RBD-hez, az összes SARS-CoV-2 aggodalomra okot adó variánshoz (VOC) és a SARS-CoV RBD-hez. Az epitóp semlegesítette a SARS-CoV-S pszeudotípusú vírusokat, de nem az ACE2 (angiotenzin konvertáló enzim 2) receptorkötődésével versengve.

Az epitóp inkább semlegesítette a pszeudotipizált SARS-CoV LV-ket, amelyek átmenetileg elérhetőek voltak az S-fehérje domének közötti mozgása révén, és destabilizálta a prefúziós komplexet. Az epitóp egy rejtélyes hasadékban lokalizálódott az RBD belső felületén, amely helyen átfedésben volt néhány széles SARS-CoV-2 ellenes Abs, mint például az S2H97, 7D6/6D6 és FD20 lábnyomaival.

A széles körben aktív CDRH3-at egy szerény szekvencia-diverzitású könyvtárból izolálták, kiemelve a szarvasmarha-rendszerben rejlő hatalmas potenciált, mint forrást széles körben aktív Abs előállítására, amely védelmet nyújthat új patogén organizmusok és mutáns változataik ellen. A B9-scFv az LV-transzdukált 293T sejtekből nyert scFv-k 53%-át tette ki egyetlen S-fehérje-kötő szelekció után, ami további FC-dúsítás hatására 83%-ra nőtt. Az eredmények azt mutatták, hogy a B9-scFv nagymértékben felelős az anti-S aktivitásért a könyvtárban.

A B9-scFv-t átmenetileg expresszáló sejtek az S-hez, az RBD-hez és az S1-hez kötődtek, de az S2-hez nem, ami azt jelzi, hogy a B9-scFv-kötőhely az RBD 319-591. aminosavainál található. A B9-scFv kötődése S-fehérjével transzfektált sejtekhez koncentrációfüggő volt az ultrahosszú scFv-hez képest.

Nevezetesen, a B9-scFv nem mutatott reaktivitást a nem transzfektált sejtekkel, még 5 mM koncentrációknál sem egy órán keresztül, ami erősen jelzi a specifikus S-Ab kölcsönhatást. A B9-scFv-S kötődését mutációk, például N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N és L452R tartják fenn a SARS-CoV-2 VOC-kban, mint például a béta, alfa, delta, gamma, omicron és gamma. Az eredmények széles keresztreaktivitást jeleztek a B9 és scFv között.

A SARS-CoV-2 variáns RBD-khez való kötődési affinitása hasonló volt a vad típusú (wt) S-hez képest, ami alátámasztja a B9 scFv egy erősen célzott és konzervált epitóphoz való kötődésének megfigyelését. A SARS-célzott humán CR3022 scFv és B9 scFv viszonylag nem reagált a közel-keleti légúti szindróma CoV (MERS-CoV) RBD-vel, ami arra utal, hogy a B9 scFv SARS-CoV-specifikus.

Csak csekély eltérés volt megfigyelhető a B9-scFv 200 nM-hoz és 2,0 μM SARS-CoV RBD-hez való kötődésében, ami nanomoláris kötési affinitást jelez. A B9-scFv szinte teljesen (98%) semlegesítette a SARS-CoV S-vel (Urbani törzs) pszeudotipizált LV-részecskéket 70 μg/ml koncentrációban, de nem mutatott ilyen hatást egyenértékű SARS-CoV-2 titereknél. A pszeudotipizált SARS-CoV LV B9-scFv-vel történő semlegesítésénél a maximális gátló koncentráció fele (IC50) 468 nM volt.

Összességében a vizsgálati eredmények rávilágítottak az ultrahosszú CDRH3-as in vitro expresszált szarvasmarha Abs-okban rejlő lehetőségre, amellyel új és széles körben hatékony terápiás anyagokat izolálhatnak a feltörekvő patogén organizmusok és azok variánsai ellen, valamint azonosíthatják a vakcinafejlesztés elsődleges epitópjait. A csapat alátámasztotta azokat a korábban publikált eredményeket, amelyek szerint az ultrahosszú CDRH3 régiók viszonylag invariáns Vλ könnyű láncokkal párosulnak, így olyan scFv templátot hoznak létre, amelyen az ultrahosszú nehézlánc-könyvtárak klónozhatók és expresszálhatók.

Referencia:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675