È stato scoperto che la regione H3 dei bovini che determina la complementarità ultra lunga reagisce in modo crociato con i sarbecovirus

È stato scoperto che la regione H3 dei bovini che determina la complementarità ultra lunga reagisce in modo crociato con i sarbecovirus

In uno studio recentemente pubblicato su Giornale di chimica biologica I ricercatori hanno condotto un’analisi in vitro per isolare catene pesanti bovine ultra lunghe che mostravano legame con la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) e i relativi coronavirus (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

sfondo

Gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi ampiamente neutralizzanti (Abs) hanno un enorme potenziale come terapie antivirali grazie alla loro capacità di identificare epitopi altamente conservati che raramente sono mutati nelle varianti virali. Un sottoinsieme di Ab bovini possiede una regione determinante la complementarità ultralunga (CDR) H3, che è ideale per identificare epitopi virali conservati; Tuttavia, la loro attività contro le proteine ​​​​spike (S) del sarbecovirus non è ben caratterizzata e richiede ulteriori indagini.

A proposito dello studio

Nel presente studio di prova di principio, i ricercatori miravano a isolare catene pesanti bovine ultra lunghe che potrebbero legarsi alle proteine ​​del sarbecovirus S in vitro.

Lo screening della superficie cellulare dei mammiferi è stato utilizzato per selezionare le librerie di anticorpi CDRH3 ultralunghi. Gli esoni variabili del gDNA dei leucociti bovini (acido desossiribonucleico genomico) sono stati amplificati per generare una libreria di paratopi bovini ultralunghi. L'arricchimento delle regioni CDRH3 ultralunghe è stato quindi eseguito mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e selezione delle dimensioni per creare una libreria di CDRH3 ultralunghi.

Successivamente, il team ha inserito gli ampliconi nella cassetta pBovShow. Ha esaminato la libreria proteica di frammenti variabili a catena singola ultra lunga (scFv) per identificare il collegamento S di SARS-CoV-2 trasfettando transitoriamente la libreria scFv nelle cellule 293T ed eseguendo l’analisi FC. Per aumentare l'efficienza dell'isolamento degli scFv(s) che legano S, la libreria è stata clonata in vettori LV (lentivirus) e le particelle LV pseudotipizzate con il virus della stomatite vescicolare (VSV) sono state generate e trasdotte nelle cellule 293T per ottenere sequenze scFv combinate per ciascuna cellula.

Un totale di 15 SCC (cloni a singola cellula) hanno mostrato interazione S, tre dei quali contenevano tre scFv con una sequenza nucleotidica identica, designata B9-scFv. Per individuare l’epitopo di B9-scFv, le subunità S, il dominio di legame del recettore S1, S2 e S1 (RBD) di SARS-CoV-2 sono stati purificati utilizzando l’analisi IMAC (cromatografia di affinità con metalli immobilizzati). Per studiare il meccanismo di legame degli anticorpi, è stata eseguita la spettrometria di massa (MS) a scambio differenziale idrogeno-deuterio.

Risultati

Un epitopo CDRH3 ampiamente reattivo e ultra lungo scFv (B9-scFv) è stato isolato da una libreria di catene pesanti naive di SARS-CoV-2 che mostrava il legame con SARS-CoV-2 RBD, tutte le varianti SARS-CoV-2 di preoccupazione (VOC) e SARS-CoV RBD. L’epitopo ha neutralizzato i virus pseudotipizzati SARS-CoV-S, ma non attraverso la competizione con il legame del recettore ACE2 (enzima di conversione dell’angiotensina 2).

Piuttosto, l’epitopo ha neutralizzato i LV SARS-CoV pseudotipizzati che erano transitoriamente disponibili tramite movimenti della proteina S tra domini e hanno destabilizzato il complesso di prefusione. L’epitopo era localizzato in una fessura criptica sulla superficie interna dell’RBD, una posizione che si sovrapponeva alle impronte di alcuni ampi anticorpi anti-SARS-CoV-2 come S2H97, 7D6/6D6 e FD20.

Il CDRH3 ampiamente attivo è stato isolato da una modesta libreria di diversità di sequenza, evidenziando l'enorme potenziale del sistema bovino come fonte per ottenere Abs ampiamente attivi che possono fornire protezione contro nuovi organismi patogeni e le loro varianti mutanti. B9-scFv comprendeva il 53% degli scFv ottenuti da cellule 293T trasdotte dal LV dopo una selezione di legame con una singola proteina S, che aumentava all'83% dopo un ulteriore arricchimento di FC. I risultati hanno mostrato che B9-scFv era in gran parte responsabile dell'attività anti-S nella libreria.

Le cellule che esprimono transitoriamente B9-scFv hanno mostrato legame con S, RBD e S1, ma non con S2, indicando che il sito di legame di B9-scFv era situato nel residuo aminoacidico di RBD da 319 a 591. Il legame di B9-scFv con le cellule trasfettate con proteina S era dipendente dalla concentrazione e arricchito rispetto ai controlli scFv ultralunghi.

In particolare, B9-scFv non ha mostrato reattività con cellule non trasfettate, anche a concentrazioni di cinque mM in un'ora, indicando fortemente un'interazione S-Ab specifica. Il legame B9-scFv-S è stato mantenuto tramite mutazioni come N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N e L452R nei COV SARS-CoV-2 come Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron e Gamma. I risultati hanno indicato un'ampia reattività crociata tra B9 e scFv.

L’affinità di legame con gli RBD varianti di SARS-CoV-2 era paragonabile rispetto alla S wild-type (in peso), supportando l’osservazione del legame di scFv B9 con un epitopo altamente mirato e conservato. scFv umano CR3022 e B9 scFv umano mirato alla SARS erano relativamente non reattivi con il RBD della sindrome respiratoria del Medio Oriente CoV (MERS-CoV), suggerendo che B9 scFv era specifico per SARS-CoV.

È stata osservata solo una leggera differenza nel legame di B9-scFv a 200 nM e 2,0 μM SARS-CoV RBD, indicando un’affinità di legame nanomolare. B9-scFv ha neutralizzato quasi completamente (98%) le particelle LV pseudotipate con SARS-CoV S (ceppo Urbani) a una concentrazione di 70 μg/ml, ma non ha mostrato tali effetti a titoli SARS-CoV-2 equivalenti. Il valore di concentrazione inibitoria semimassima (IC50) per la neutralizzazione del LV SARS-CoV pseudotipato da parte di B9-scFv era 468 nM.

Nel complesso, i risultati dello studio hanno evidenziato il potenziale degli Abs bovini espressi in vitro con CDRH3 ultralunghi per isolare terapie nuove e ampiamente efficaci per combattere gli organismi patogeni emergenti e le loro varianti, nonché per identificare epitopi primari per lo sviluppo di vaccini. Il team ha supportato i risultati precedentemente pubblicati secondo cui le regioni CDRH3 ultralunghe si accoppiano con catene leggere Vλ relativamente invarianti per creare un modello scFv su cui le librerie di catene pesanti ultralunghe possono essere clonate ed espresse.

Riferimento:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675