Nustatyta, kad itin ilgas galvijų komplementarumą lemiantis regionas H3 kryžmiškai reaguoja su sarbekovirusais

Nustatyta, kad itin ilgas galvijų komplementarumą lemiantis regionas H3 kryžmiškai reaguoja su sarbekovirusais

Neseniai paskelbtame tyrime Biologinės chemijos žurnalas Tyrėjai atliko in vitro analizę, kad išskirtų itin ilgas galvijų sunkiąsias grandines, kurios prisijungė prie sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) ir susijusių koronavirusų (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

fone

Tyrimai parodė, kad plačiai neutralizuojantys antikūnai (Abs) turi didžiulį antivirusinių vaistų potencialą dėl jų gebėjimo identifikuoti labai konservuotus epitopus, kurie retai mutuoja viruso variantuose. Galvijų Ab pogrupis turi itin ilgą komplementarumą lemiantį regioną (CDR)H3, kuris idealiai tinka identifikuoti konservuotus viruso epitopus; Tačiau jų aktyvumas prieš sarbekoviruso smaigalio (S) baltymus nėra gerai apibūdintas ir reikalauja tolesnio tyrimo.

Apie studiją

Šiame principo įrodymo tyrime mokslininkai siekė išskirti itin ilgas galvijų sunkiąsias grandines, kurios in vitro galėtų prisijungti prie sarbekoviruso S baltymų.

Žinduolių ląstelių paviršiaus atranka buvo naudojama ultrailgoms CDRH3 Ab bibliotekoms patikrinti. Kintamieji karvių leukocitų gDNR (genominės dezoksiribonukleino rūgšties) egzonai buvo sustiprinti, kad būtų sukurta itin ilgų galvijų paratopų biblioteka. Tada ultrailgų CDRH3 sričių praturtinimas buvo atliktas polimerazės grandinine reakcija (PGR) ir dydžio parinkimu, kad būtų sukurta itin ilgų CDRH3 biblioteka.

Tada komanda įdėjo amplikonus į pBovShow kasetę. Jis ištyrė itin ilgos vienos grandinės kintamo fragmento (scFv) baltymų biblioteką, kad nustatytų SARS-CoV-2 S ryšį, laikinai transfekuojant scFv biblioteką į 293T ląsteles ir atlikus FC analizę. Siekiant padidinti S surišimo scFv (-ų) išskyrimo efektyvumą, biblioteka buvo klonuota į LV vektorius (lentivirusą), o LV dalelės, pseudotipas su vezikulinio stomatito virusu (VSV), buvo sukurtos ir transdukuotos 293T ląstelėse, kad būtų gautos kombinuotos kiekvienos ląstelės scFv sekos.

Iš viso 15 SCC (pavienių ląstelių klonų) parodė S sąveiką, iš kurių trijose buvo trys scFv su identiška nukleotidų seka, pažymėta B9-scFv. Norint nustatyti B9-scFv epitopą, SARS-CoV-2 S subvienetai, S1, S2 ir S1 receptorių surišimo domenas (RBD) buvo išgryninti naudojant IMAC (imobilizuotos metalo afininės chromatografijos) analizę. Norint ištirti antikūnų surišimo mechanizmą, buvo atlikta diferencinė vandenilio-deuterio mainų masės spektrometrija (MS).

Rezultatai

Plačiai reaktyvus ir itin ilgas scFv (B9-scFv) CDRH3 epitopas buvo išskirtas iš SARS-CoV-2 naivios sunkiosios grandinės bibliotekos, kuri parodė ryšį su SARS-CoV-2 UBR, visais SARS-CoV-2 variantais (LOJ) ir SARS-CoV UBR. Epitopas neutralizavo SARS-CoV-S pseudotipo virusus, bet ne konkuruodamas su ACE2 (angiotenziną konvertuojančio fermento 2) receptorių prisijungimu.

Atvirkščiai, epitopas neutralizavo pseudotipinius SARS-CoV LV, kurie buvo laikinai prieinami per S baltymų judėjimą tarp domenų ir destabilizavo prefuzijos kompleksą. Epitopas lokalizuotas paslaptingame plyšyje vidiniame UBR paviršiuje – vietoje, kuri sutapo su kelių plačių anti-SARS-CoV-2 Abs, tokių kaip S2H97, 7D6/6D6 ir FD20, pėdsakais.

Plačiai aktyvus CDRH3 buvo išskirtas iš nedidelės sekos įvairovės bibliotekos, pabrėžiant didžiulį galvijų sistemos potencialą, kaip šaltinį gauti plačiai aktyvių Abs, galinčių apsaugoti nuo naujų patogeninių organizmų ir jų mutantų variantų. B9-scFv sudarė 53% scFv, gautų iš LV transdukuotų 293T ląstelių po vienos S baltymo surišimo atrankos, kuri padidėjo iki 83% toliau sodrinant FC. Rezultatai parodė, kad B9-scFv daugiausia buvo atsakingas už anti-S aktyvumą bibliotekoje.

Ląstelės, laikinai ekspresuojančios B9-scFv, prisijungė prie S, RBD ir S1, bet ne prie S2, o tai rodo, kad B9-scFv surišimo vieta buvo UBD aminorūgščių liekanose nuo 319 iki 591. B9-scFv prisijungimas prie S baltymu transfekuotų ląstelių buvo priklausomas nuo koncentracijos, palyginti su kontroline ir itin ilgai praturtinta scFv.

Pažymėtina, kad B9-scFv neparodė jokio reaktyvumo su netransfekuotomis ląstelėmis, net esant penkių mM koncentracijoms per vieną valandą, o tai aiškiai rodo specifinę S-Ab sąveiką. B9-scFv-S surišimas buvo palaikomas per mutacijas, tokias kaip N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N ir L452R SARS-CoV-2 LOJ, tokiuose kaip Beta, Alfa, Delta, Gama, Omicron ir Gamma. Rezultatai parodė platų kryžminį reaktyvumą tarp B9 ir scFv.

Surišimo afinitetas su SARS-CoV-2 varianto UBR buvo panašus, palyginti su laukinio tipo (wt) S, o tai patvirtina B9 scFv prisijungimo prie labai tikslinio ir konservuoto epitopo stebėjimą. Į SARS nukreipti žmogaus CR3022 scFv ir B9 scFv buvo santykinai neaktyvūs su Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo CoV (MERS-CoV) UBR, o tai rodo, kad B9 scFv buvo specifinis SARS-CoV.

Buvo pastebėtas tik nedidelis B9-scFv prisijungimo prie 200 nM ir 2, 0 μM SARS-CoV UBR skirtumas, o tai rodo nanomolinį surišimo afinitetą. B9-scFv beveik visiškai (98 %) neutralizavo KS daleles, pseudotipą su SARS-CoV S (Urbani štamas), kurių koncentracija buvo 70 μg/ml, tačiau tokio poveikio neparodė lygiaverčiai SARS-CoV-2 titrai. Pusė didžiausios slopinančios koncentracijos vertė (IC50) pseudotipo SARS-CoV KS neutralizavimui B9-scFv buvo 468 nM.

Apskritai tyrimo rezultatai išryškino in vitro ekspresuotų galvijų Abs su itin ilgais CDRH3 potencialą išskirti naujus ir plačiai veiksmingus vaistus, skirtus kovoti su naujais patogeniniais organizmais ir jų variantais, taip pat nustatyti pagrindinius vakcinos kūrimo epitopus. Grupė pritarė anksčiau paskelbtoms išvadoms, kad itin ilgos CDRH3 sritys poruojasi su santykinai invariantinėmis Vλ lengvosiomis grandinėmis, kad sukurtų scFv šabloną, ant kurio būtų galima klonuoti ir ekspresuoti itin ilgas sunkiųjų grandinių bibliotekas.

Nuoroda:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675