Den ultralange komplementaritetsbestemmende regionen H3 til storfe ble funnet å kryssreagere med sarbecovirus

Den ultralange komplementaritetsbestemmende regionen H3 til storfe ble funnet å kryssreagere med sarbecovirus

I en nylig publisert studie i Journal of Biological Chemistry Forskere utførte en in vitro-analyse for å isolere ultralange bovine tunge kjeder som viste binding med alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) og relaterte koronavirus (CoVs).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

bakgrunn

Studier har vist at bredt nøytraliserende antistoffer (Abs) har et enormt potensial som antivirale terapeutiske midler på grunn av deres evne til å identifisere svært konserverte epitoper som sjelden er mutert i virusvarianter. En bovin Ab-undergruppe har en ultralang komplementaritetsbestemmende region (CDR)H3, som er ideell for å identifisere konserverte virale epitoper; Imidlertid er deres aktivitet mot sarbecovirus spike (S) proteiner ikke godt karakterisert og krever videre undersøkelse.

Om studiet

I den nåværende proof-of-principle-studien hadde forskerne som mål å isolere ultralange bovine tunge kjeder som kunne binde seg til sarbecovirus S-proteiner in vitro.

Pattedyrcelleoverflatescreening ble brukt til å screene ultralange CDRH3 Ab-biblioteker. De variable eksonene av ku-leukocytt-gDNA (genomisk deoksyribonukleinsyre) ble amplifisert for å generere et bibliotek av ultralange bovine paratoper. Anrikning av de ultralange CDRH3-områdene ble deretter utført ved polymerasekjedereaksjon (PCR) og størrelsesvalg for å lage et bibliotek av ultralange CDRH3-er.

Deretter satte teamet amplikonene inn i pBovShow-kassetten. Den undersøkte det ultralange enkeltkjede-variable fragmentet (scFv) proteinbiblioteket for å identifisere S-koblingen til SARS-CoV-2 ved forbigående transfeksjon av scFv-biblioteket inn i 293T-cellene og utføre FC-analyse. For å øke effektiviteten av S-bindende scFv(er)-isolasjon, ble biblioteket klonet inn i LV-vektorer (lentivirus), og LV-partikler pseudotypet med vesikulært stomatittvirus (VSV) ble generert og transdusert i 293T-cellene for å oppnå kombinerte scFv-sekvenser for hver celle.

Totalt 15 SCC-er (enkeltcellekloner) viste S-interaksjon, hvorav tre inneholdt tre scFv-er med en identisk nukleotidsekvens, betegnet B9-scFv. For å lokalisere epitopen til B9-scFv ble S-underenhetene, S1-, S2- og S1-reseptorbindende domene (RBD) til SARS-CoV-2 renset ved bruk av IMAC-analyse (immobilisert metallaffinitetskromatografi). For å undersøke mekanismen for antistoffbinding ble differensiell hydrogen-deuterium-utvekslingsmassespektrometri (MS) utført.

Resultater

En bredt reaktiv og en ultralang scFv (B9-scFv) CDRH3-epitop ble isolert fra et SARS-CoV-2-naivt tungkjedebibliotek som viste binding til SARS-CoV-2 RBD, alle SARS-CoV-2-varianter av bekymring (VOC) og SARS-CoV RBD. Epitopen nøytraliserte SARS-CoV-S pseudotypede virus, men ikke gjennom konkurranse med ACE2 (angiotensinkonverterende enzym 2) reseptorbinding.

Snarere nøytraliserte epitopen pseudotype SARS-CoV LV-er som var forbigående tilgjengelig via S-proteinbevegelser mellom domener og destabiliserte prefusjonskomplekset. Epitopen lokaliserte seg til en kryptisk kløft på den indre overflaten av RBD, et sted som overlappet med fotavtrykk av noen få brede anti-SARS-CoV-2 Abs som S2H97, 7D6/6D6 og FD20.

Den bredt aktive CDRH3 ble isolert fra et beskjedent sekvensdiversitetsbibliotek, og fremhever det enorme potensialet til storfesystemet som en kilde for å oppnå bredt aktive Abs som kan gi beskyttelse mot nye patogene organismer og deres mutante varianter. B9-scFv utgjorde 53 % av scFv-ene oppnådd fra LV-transduserte 293T-celler etter en enkelt S-proteinbindingsseleksjon, som økte til 83 % ved ytterligere FC-anrikning. Resultatene viste at B9-scFv i stor grad var ansvarlig for anti-S-aktiviteten i biblioteket.

Celler som midlertidig uttrykker B9-scFv viste binding til S, RBD og S1, men ikke til S2, noe som indikerer at B9-scFv-bindingssetet var lokalisert ved RBD-aminosyrerest 319 til 591. Bindingen av B9-scFv til S-proteintransfekterte celler var konsentrasjonsavhengige og ultralange scF-anrikede celler.

Spesielt viste B9-scFv ingen reaktivitet med utransfekterte celler, selv ved konsentrasjoner på fem mM over en time, noe som sterkt indikerer en spesifikk S-Ab-interaksjon. B9-scFv-S-binding ble opprettholdt via mutasjoner som N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N og L452R i SARS-CoV-2 VOC som Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron og Gamma. Resultatene indikerte bred kryssreaktivitet mellom B9 og scFv.

Bindingsaffinitet til SARS-CoV-2 variant RBD-er var sammenlignbar sammenlignet med villtype (wt) S, noe som støtter observasjonen av B9 scFv-binding til en svært målrettet og konservert epitop. SARS-målrettet human CR3022 scFv og B9 scFv var relativt lite reaktive med Midtøsten Respiratory Syndrome CoV (MERS-CoV) RBD, noe som tyder på at B9 scFv var SARS-CoV-spesifikk.

Bare en liten forskjell ble observert i B9-scFv-binding til 200 nM og 2,0 μM SARS-CoV RBD, noe som indikerer nanomolar bindingsaffinitet. B9-scFv nesten fullstendig (98%) nøytraliserte LV-partikler pseudotypet med SARS-CoV S (Urbani-stamme) ved en konsentrasjon på 70 μg/ml, men viste ingen slike effekter ved tilsvarende SARS-CoV-2-titre. Den halvmaksimale hemmende konsentrasjonsverdien (IC50) for pseudotype SARS-CoV LV-nøytralisering ved B9-scFv var 468 nM.

Samlet sett fremhevet studieresultatene potensialet til in vitro-uttrykte bovine Abs med ultralange CDRH3-er for å isolere nye og bredt effektive terapier for å bekjempe fremvoksende patogene organismer og deres varianter, samt å identifisere hovedepitoper for vaksineutvikling. Teamet støttet tidligere publiserte funn om at ultralange CDRH3-regioner parer seg med relativt invariante Vλ-lette kjeder for å lage en scFv-mal som ultralange tungkjedebiblioteker kan klones og uttrykkes på.

Referanse:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675