Stwierdzono, że ultradługi region determinujący komplementarność bydła H3 reaguje krzyżowo z sarbekowirusami

Stwierdzono, że ultradługi region determinujący komplementarność bydła H3 reaguje krzyżowo z sarbekowirusami

W niedawno opublikowanym badaniu w Journal of Chemii Biologicznej Naukowcy przeprowadzili analizę in vitro w celu wyizolowania bardzo długich bydlęcych łańcuchów ciężkich, które wykazały wiązanie z koronawirusem 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2) i pokrewnymi koronawirusami (CoV).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

tło

Badania wykazały, że przeciwciała o szerokim spektrum działania (Abs) mają ogromny potencjał jako leki przeciwwirusowe ze względu na ich zdolność do identyfikowania wysoce konserwatywnych epitopów, które rzadko ulegają mutacji w wariantach wirusa. Bydlęcy podzbiór Ab posiada ultradługi region determinujący komplementarność (CDR)H3, który jest idealny do identyfikacji konserwatywnych epitopów wirusowych; Jednakże ich aktywność wobec białek kolców sarbekowirusa (S) nie jest dobrze scharakteryzowana i wymaga dalszych badań.

O badaniu

W niniejszym badaniu weryfikującym zasadę badacze mieli na celu wyizolowanie bardzo długich bydlęcych łańcuchów ciężkich, które mogłyby wiązać się z białkami S sarbekowirusa in vitro.

Do przeszukiwania ultradługich bibliotek Ab CDRH3 zastosowano badanie przesiewowe powierzchni komórek ssaków. Zmienne eksony gDNA leukocytów krowy (genomowy kwas dezoksyrybonukleinowy) amplifikowano w celu wytworzenia biblioteki ultradługich paratopów bydlęcych. Następnie przeprowadzono wzbogacanie ultradługich regionów CDRH3 za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i selekcji wielkości, aby utworzyć bibliotekę ultradługich regionów CDRH3.

Następnie zespół umieścił amplikony w kasecie pBovShow. Zbadano bibliotekę białkową ultradługich jednołańcuchowych fragmentów zmiennych (scFv) w celu zidentyfikowania wiązania S wirusa SARS-CoV-2 poprzez przejściową transfekcję biblioteki scFv do komórek 293T i przeprowadzenie analizy FC. Aby zwiększyć skuteczność izolacji scFv(ów) wiążących S, bibliotekę sklonowano do wektorów LV (lentiwirus) i wygenerowano pseudotypowane cząstki LV wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) i transdukowano je w komórkach 293T w celu uzyskania połączonych sekwencji scFv dla każdej komórki.

Łącznie 15 SCC (klonów pojedynczych komórek) wykazywało interakcję S, z których trzy zawierały trzy scFv o identycznej sekwencji nukleotydowej, oznaczone jako B9-scFv. Aby zlokalizować epitop B9-scFv, podjednostki S, domeny wiążące receptor S1, S2 i S1 (RBD) SARS-CoV-2 oczyszczono za pomocą analizy IMAC (chromatografia powinowactwa z unieruchomionym metalem). Aby zbadać mechanizm wiązania przeciwciał, przeprowadzono różnicową spektrometrię mas z wymianą wodoru i deuteru (MS).

Wyniki

Szeroko reaktywny i bardzo długi epitop CDRH3 scFv (B9-scFv) wyizolowano z naiwnej biblioteki łańcuchów ciężkich SARS-CoV-2, która wykazywała wiązanie z SARS-CoV-2 RBD, wszystkimi budzącymi obawy wariantami SARS-CoV-2 (LZO) i SARS-CoV RBD. Epitop neutralizował pseudotypowane wirusy SARS-CoV-S, ale nie poprzez współzawodnictwo z wiązaniem receptora ACE2 (enzym konwertujący angiotensynę 2).

Przeciwnie, epitop neutralizował pseudotypowane LV SARS-CoV, które były przejściowo dostępne poprzez ruchy białka S między domenami i destabilizowały kompleks prefuzyjny. Epitop zlokalizowany w tajemniczej szczelinie na wewnętrznej powierzchni RBD, w miejscu, które pokrywało się ze śladami kilku szerokich Ab anty-SARS-CoV-2, takich jak S2H97, 7D6/6D6 i FD20.

Szeroko aktywny CDRH3 wyizolowano ze skromnej biblioteki różnorodności sekwencji, co podkreśla ogromny potencjał układu bydlęcego jako źródła otrzymywania szeroko aktywnych Ab, które mogą zapewnić ochronę przed nowymi organizmami chorobotwórczymi i ich zmutowanymi wariantami. B9-scFv obejmował 53% scFv uzyskanych z komórek 293T transdukowanych LV po pojedynczej selekcji wiązania białka S, która wzrosła do 83% po dalszym wzbogacaniu FC. Wyniki pokazały, że B9-scFv był w dużej mierze odpowiedzialny za aktywność anty-S w bibliotece.

Komórki przejściowo wyrażające B9-scFv wykazywały wiązanie z S, RBD i S1, ale nie z S2, co wskazuje, że miejsce wiązania B9-scFv było zlokalizowane przy resztach aminokwasowych RBD od 319 do 591. Wiązanie B9-scFv z komórkami transfekowanymi białkiem S było zależne od stężenia i wzbogacone w porównaniu z ultradługimi kontrolami scFv.

Warto zauważyć, że B9-scFv nie wykazywał reaktywności z nietransfekowanymi komórkami, nawet przy stężeniach pięciu mM w ciągu jednej godziny, co silnie wskazuje na specyficzną interakcję S-Ab. Wiązanie B9-scFv-S zostało utrzymane poprzez mutacje, takie jak N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N i L452R w LZO SARS-CoV-2, takich jak Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron i Gamma. Wyniki wykazały szeroką reaktywność krzyżową pomiędzy B9 i scFv.

Powinowactwo wiązania z RBD wariantu SARS-CoV-2 było porównywalne w porównaniu z S typu dzikiego (wt), co potwierdza obserwację wiązania scFv B9 z wysoce ukierunkowanym i konserwatywnym epitopem. Ludzkie scFv i B9 scFv ukierunkowane na SARS były stosunkowo niereaktywne w przypadku RBD bliskowschodniego zespołu oddechowego CoV (MERS-CoV), co sugeruje, że scFv B9 było specyficzne dla SARS-CoV.

Zaobserwowano jedynie niewielką różnicę w wiązaniu B9-scFv z 200 nM i 2,0 µM SARS-CoV RBD, co wskazuje na nanomolowe powinowactwo wiązania. B9-scFv prawie całkowicie (98%) neutralizował cząstki LV pseudotypowane SARS-CoV S (szczep Urbani) w stężeniu 70 µg/ml, ale nie wykazywał takich efektów przy równoważnych mianach SARS-CoV-2. Połowa maksymalnej wartości stężenia hamującego (IC50) dla pseudotypowanej neutralizacji SARS-CoV LV przez B9-scFv wyniosła 468 nM.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badania podkreśliły potencjał bydlęcych Abs wykazujących ekspresję in vitro z ultradługimi CDRH3 w izolowaniu nowych i szeroko skutecznych środków terapeutycznych do zwalczania pojawiających się organizmów chorobotwórczych i ich wariantów, a także w identyfikowaniu głównych epitopów do opracowania szczepionek. Zespół poparł wcześniej opublikowane ustalenia, że ​​ultradługie regiony CDRH3 łączą się w pary ze stosunkowo niezmiennymi łańcuchami lekkimi Vλ, tworząc matrycę scFv, na której można klonować i wyrażać biblioteki ultradługich łańcuchów ciężkich.

Odniesienie:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675