Descobriu-se que a região determinante de complementaridade ultralonga H3 do gado apresenta reação cruzada com sarbecovírus

Descobriu-se que a região determinante de complementaridade ultralonga H3 do gado apresenta reação cruzada com sarbecovírus

Num estudo recentemente publicado no Revista de Química Biológica Os pesquisadores conduziram uma análise in vitro para isolar cadeias pesadas bovinas ultralongas que mostraram ligação com o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) e coronavírus relacionados (CoVs).

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

fundo

Estudos demonstraram que os anticorpos amplamente neutralizantes (Abs) têm um enorme potencial como terapêutica antiviral devido à sua capacidade de identificar epítopos altamente conservados que raramente sofrem mutação em variantes do vírus. Um subconjunto Ab bovino possui uma região determinante de complementaridade ultralonga (CDR) H3, que é ideal para identificar epítopos virais conservados; No entanto, a sua actividade contra as proteínas spike (S) do sarbecovírus não está bem caracterizada e requer investigação adicional.

Sobre o estudo

No presente estudo de prova de princípio, os pesquisadores tiveram como objetivo isolar cadeias pesadas bovinas ultralongas que pudessem se ligar às proteínas S do sarbecovírus in vitro.

O rastreio da superfície celular de mamíferos foi utilizado para rastrear bibliotecas ultralongas de CDRH3 Ab. Os exons variáveis ​​​​do gDNA de leucócitos de vaca (ácido desoxirribonucléico genômico) foram amplificados para gerar uma biblioteca de parátopos bovinos ultralongos. O enriquecimento das regiões CDRH3 ultralongas foi então realizado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e seleção de tamanho para criar uma biblioteca de CDRH3 ultralongas.

Em seguida, a equipe inseriu os amplicons no cassete pBovShow. Ele examinou a biblioteca de proteínas de fragmentos variáveis ​​de cadeia única ultralonga (scFv) para identificar a ligação S do SARS-CoV-2 transfectando transitoriamente a biblioteca scFv nas células 293T e realizando a análise FC. Para aumentar a eficiência do isolamento de scFv(s) de ligação a S, a biblioteca foi clonada em vetores LV (lentivírus) e partículas de LV pseudotipadas com vírus da estomatite vesicular (VSV) foram geradas e transduzidas nas células 293T para obter sequências scFv combinadas para cada célula.

Um total de 15 SCCs (clones de células únicas) apresentaram interação S, três dos quais continham três scFvs com uma sequência de nucleotídeos idêntica, designada B9-scFv. Para localizar o epítopo de B9-scFv, as subunidades S, domínio de ligação ao receptor S1, S2 e S1 (RBD) do SARS-CoV-2 foram purificadas usando análise IMAC (cromatografia de afinidade de metal imobilizado). Para investigar o mecanismo de ligação do anticorpo, foi realizada espectrometria de massa (MS) de troca diferencial de hidrogênio-deutério.

Resultados

Um epítopo CDRH3 scFv (B9-scFv) amplamente reativo e ultralongo foi isolado de uma biblioteca de cadeia pesada ingênua de SARS-CoV-2 que mostrou ligação ao SARS-CoV-2 RBD, todas as variantes preocupantes do SARS-CoV-2 (VOCs) e SARS-CoV RBD. O epítopo neutralizou os vírus pseudotipados do SARS-CoV-S, mas não através da competição com a ligação do receptor ACE2 (enzima de conversão da angiotensina 2).

Em vez disso, o epítopo neutralizou LVs SARS-CoV pseudotipados que estavam transitoriamente disponíveis através de movimentos da proteína S entre domínios e desestabilizou o complexo de pré-fusão. O epítopo localizado em uma fenda enigmática na superfície interna do RBD, um local que se sobrepunha a pegadas de alguns Abs anti-SARS-CoV-2 amplos, como S2H97, 7D6/6D6 e FD20.

O CDRH3 amplamente ativo foi isolado de uma modesta biblioteca de diversidade de sequências, destacando o enorme potencial do sistema bovino como fonte para a obtenção de Abs amplamente ativos que podem fornecer proteção contra novos organismos patogênicos e suas variantes mutantes. B9-scFv compreendia 53% dos scFvs obtidos de células 293T transduzidas com LV após uma única seleção de ligação à proteína S, que aumentou para 83% após enriquecimento adicional de FC. Os resultados mostraram que o B9-scFv foi em grande parte responsável pela atividade anti-S na biblioteca.

As células que expressam transitoriamente B9-scFv mostraram ligação a S, RBD e S1, mas não a S2, indicando que o sítio de ligação de B9-scFv estava localizado no resíduo de aminoácido RBD 319 a 591. A ligação de B9-scFv a células transfectadas com proteína S foi dependente da concentração e enriquecida em comparação com controles de scFv ultralongos.

Notavelmente, o B9-scFv não apresentou reactividade com células não transfectadas, mesmo em concentrações de cinco mM durante uma hora, indicando fortemente uma interacção S-Ab específica. A ligação de B9-scFv-S foi mantida através de mutações como N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N e L452R em VOCs SARS-CoV-2, como Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron e Gamma. Os resultados indicaram ampla reatividade cruzada entre B9 e scFv.

A afinidade de ligação aos RBDs variantes do SARS-CoV-2 foi comparável em comparação com o S do tipo selvagem (wt), apoiando a observação da ligação do scFv B9 a um epítopo altamente direcionado e conservado. O scFv humano CR3022 e o scFv B9 direcionados ao SARS foram relativamente pouco reativos com o RBD da Síndrome Respiratória do Oriente Médio CoV (MERS-CoV), sugerindo que o scFv B9 era específico do SARS-CoV.

Apenas uma ligeira diferença foi observada na ligação de B9-scFv a 200 nM e 2,0 μM de SARS-CoV RBD, indicando afinidade de ligação nanomolar. B9-scFv neutralizou quase completamente (98%) partículas de VE pseudotipadas com SARS-CoV S (cepa Urbani) em uma concentração de 70 μg/ml, mas não mostrou tais efeitos em títulos equivalentes de SARS-CoV-2. O valor da metade da concentração inibitória máxima (IC50) para a neutralização pseudotipada do SARS-CoV LV por B9-scFv foi de 468 nM.

No geral, os resultados do estudo destacaram o potencial dos Abs bovinos expressos in vitro com CDRH3s ultralongos para isolar terapêuticas novas e amplamente eficazes para combater organismos patogênicos emergentes e suas variantes, bem como para identificar epítopos principais para o desenvolvimento de vacinas. A equipe apoiou descobertas publicadas anteriormente de que regiões CDRH3 ultralongas emparelham com cadeias leves Vλ relativamente invariantes para criar um modelo scFv no qual bibliotecas de cadeias pesadas ultralongas podem ser clonadas e expressas.

Referência:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675