Zistilo sa, že ultra dlhá oblasť určujúca komplementaritu H3 hovädzieho dobytka skrížene reaguje so sarbekovírusmi

Zistilo sa, že ultra dlhá oblasť určujúca komplementaritu H3 hovädzieho dobytka skrížene reaguje so sarbekovírusmi

V nedávno publikovanej štúdii v Journal of Biological Chemistry Výskumníci vykonali in vitro analýzu na izoláciu ultradlhých bovinných ťažkých reťazcov, ktoré vykazovali väzbu s koronavírusom 2 (SARS-CoV-2) a súvisiacimi koronavírusmi (CoV) s ťažkým akútnym respiračným syndrómom.

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

pozadia

Štúdie ukázali, že široko neutralizujúce protilátky (Abs) majú obrovský potenciál ako antivírusové terapeutiká vďaka svojej schopnosti identifikovať vysoko konzervované epitopy, ktoré sú zriedkavo mutované vo variantoch vírusu. Podskupina hovädzích Ab má ultradlhú oblasť určujúcu komplementaritu (CDR)H3, ktorá je ideálna na identifikáciu konzervovaných vírusových epitopov; Avšak ich aktivita proti sarbekovírusovým spike (S) proteínom nie je dobre charakterizovaná a vyžaduje si ďalšie skúmanie.

O štúdiu

V súčasnej štúdii overovania princípu sa výskumníci zamerali na izoláciu ultradlhých ťažkých reťazcov hovädzieho dobytka, ktoré by sa mohli viazať na proteíny sarbekovírusu S in vitro.

Skríning povrchu buniek cicavcov sa použil na skríning ultradlhých knižníc CDRH3 Ab. Variabilné exóny gDNA kravských leukocytov (genómová deoxyribonukleová kyselina) sa amplifikovali, aby sa vytvorila knižnica ultradlhých paratopov hovädzieho dobytka. Obohatenie ultradlhých oblastí CDRH3 sa potom uskutočnilo polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) a výberom veľkosti, aby sa vytvorila knižnica ultradlhých CDRH3.

Potom tím vložil amplikóny do kazety pBovShow. Skúmala proteínovú knižnicu ultradlhého jednoreťazcového variabilného fragmentu (scFv), aby sa identifikovala S-väzba SARS-CoV-2 prechodnou transfekciou knižnice scFv do buniek 293T a vykonaním FC analýzy. Na zvýšenie účinnosti izolácie scFv(s) viažuceho S sa knižnica klonovala do LV vektorov (lentivírus) a vytvorili sa častice LV pseudotypizované vírusom vezikulárnej stomatitídy (VSV) a transdukovali sa do buniek 293T, aby sa získali kombinované sekvencie scFv pre každú bunku.

Celkom 15 SCC (jednobunkové klony) vykazovalo S-interakciu, z ktorých tri obsahovali tri scFv s identickou nukleotidovou sekvenciou, označené ako B9-scFv. Na lokalizáciu epitopu B9-scFv sa podjednotky S, väzbová doména S1, S2 a S1 receptora (RBD) SARS-CoV-2 purifikovali pomocou analýzy IMAC (imobilizovaná kovová afinitná chromatografia). Na preskúmanie mechanizmu väzby protilátky sa uskutočnila diferenciálna hmotnostná spektrometria výmeny vodíka a deutéria (MS).

Výsledky

Široko reaktívny a ultra dlhý epitop scFv (B9-scFv) CDRH3 bol izolovaný z knižnice ťažkého reťazca naivného SARS-CoV-2, ktorá vykazovala väzbu na SARS-CoV-2 RBD, všetky varianty SARS-CoV-2, ktoré sú predmetom záujmu (VOC) a SARS-CoV RBD. Epitop neutralizoval pseudotypové vírusy SARS-CoV-S, ale nie prostredníctvom konkurencie s väzbou na receptor ACE2 (angiotenzín konvertujúci enzým 2).

Epitop skôr neutralizoval pseudotypizované SARS-CoV LV, ktoré boli prechodne dostupné prostredníctvom pohybov S proteínu medzi doménami a destabilizoval prefúzny komplex. Epitop sa lokalizoval do kryptickej štrbiny na vnútornom povrchu RBD, čo je miesto, ktoré sa prekrývalo so stopami niekoľkých širokých anti-SARS-CoV-2 Ab, ako sú S2H97, 7D6/6D6 a FD20.

Široko aktívny CDRH3 bol izolovaný z knižnice skromnej sekvenčnej diverzity, čo zdôraznilo obrovský potenciál hovädzieho systému ako zdroja na získanie široko aktívnych protilátok, ktoré môžu poskytnúť ochranu proti novým patogénnym organizmom a ich mutantným variantom. B9-scFv obsahoval 53 % scFv získaných z LV-transdukovaných 293T buniek po jedinej selekcii viazania S proteínu, ktorá sa po ďalšom obohatení FC zvýšila na 83 %. Výsledky ukázali, že B9-scFv bol do značnej miery zodpovedný za anti-S aktivitu v knižnici.

Bunky prechodne exprimujúce B9-scFv vykazovali väzbu na S, RBD a S1, ale nie na S2, čo naznačuje, že väzbové miesto B9-scFv sa nachádzalo na aminokyselinovom zvyšku 319 až 591 RBD. Väzba B9-scFv na bunky transfekované S proteínom bola závislá od koncentrácie a bola obohatená v porovnaní s ultradlhými kontrolami scFv.

Je pozoruhodné, že B9-scFv nevykazoval žiadnu reaktivitu s netransfekovanými bunkami, dokonca ani pri koncentráciách 5 mM počas jednej hodiny, čo silne naznačuje špecifickú interakciu S-Ab. Väzba B9-scFv-S sa udržala prostredníctvom mutácií, ako sú napríklad N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N a L452R vo VOC SARS-CoV-2, ako sú Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron a Gamma. Výsledky ukázali širokú skríženú reaktivitu medzi B9 a scFv.

Väzbová afinita k variantom RBD SARS-CoV-2 bola porovnateľná v porovnaní s divokým typom (wt) S, čo podporuje pozorovanie väzby B9 scFv na vysoko cielený a konzervovaný epitop. Ľudské CR3022 scFv a B9 scFv zacielené na SARS boli relatívne nereaktívne s blízkovýchodným respiračným syndrómom CoV (MERS-CoV) RBD, čo naznačuje, že B9 scFv bol špecifický pre SARS-CoV.

Vo väzbe B9-scFv na 200 nM a 2, 0 uM SARS-CoV RBD sa pozoroval len malý rozdiel, čo naznačuje nanomolárnu väzbovú afinitu. B9-scFv takmer úplne (98 %) neutralizoval častice LV pseudotypizované SARS-CoV S (kmeň Urbani) v koncentrácii 70 μg/ml, ale nevykazoval žiadne takéto účinky pri ekvivalentných titroch SARS-CoV-2. Hodnota polovičnej maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50) pre pseudotypizovanú SARS-CoV LV neutralizáciu pomocou B9-scFv bola 468 nM.

Celkovo výsledky štúdie zdôraznili potenciál in vitro exprimovaných hovädzích Abs s ultradlhými CDRH3 na izoláciu nových a široko účinných terapeutík na boj proti novým patogénnym organizmom a ich variantom, ako aj na identifikáciu primárnych epitopov pre vývoj vakcín. Tím podporil skôr publikované zistenia, že ultradlhé oblasti CDRH3 sa párujú s relatívne invariantnými ľahkými reťazcami VA, aby sa vytvoril templát scFv, na ktorom možno klonovať a exprimovať knižnice ultradlhých ťažkých reťazcov.

Referencia:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675