牛超长互补决定区H3被发现与sarbecoviruses发生交叉反应

牛超长互补决定区H3被发现与sarbecoviruses发生交叉反应

在最近发表的一项研究中 生物化学杂志 研究人员进行了一项体外分析，以分离超长牛重链，该重链显示出与严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 和相关冠状病毒 (CoV) 的结合。

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

背景

研究表明，广泛中和抗体 (Abs) 具有作为抗病毒治疗的巨大潜力，因为它们能够识别在病毒变体中很少突变的高度保守的表位。 牛抗体子集拥有超长互补决定区 (CDR)H3，非常适合识别保守的病毒表位； 然而，它们针对 sarbecovirus 刺突 (S) 蛋白的活性尚未得到很好的表征，需要进一步研究。

关于该研究

在目前的原理验证研究中，研究人员旨在分离可以在体外与 sarbecovirus S 蛋白结合的超长牛重链。

使用哺乳动物细胞表面筛选来筛选超长 CDRH3 Ab 文库。 牛白细胞 gDNA（基因组脱氧核糖核酸）的可变外显子经过扩增，生成超长牛互补位文库。 然后通过聚合酶链式反应 (PCR) 和大小选择对超长 CDRH3 区域进行富集，以创建超长 CDRH3 文库。

接下来，团队将扩增子插入 pBovShow 盒中。 它检查了超长单链可变片段 (scFv) 蛋白库，通过将 scFv 库瞬时转染至 293T 细胞并进行 FC 分析来鉴定 SARS-CoV-2 的 S 连接。 为了提高 S 结合 scFv 分离的效率，将文库克隆到 LV 载体（慢病毒）中，生成用水泡性口炎病毒 (VSV) 假型化的 LV 颗粒，并在 293T 细胞中转导，以获得每个细胞的组合 scFv 序列。

总共15个SCC（单细胞克隆）显示出S-相互作用，其中三个含有三个具有相同核苷酸序列的scFv，命名为B9-scFv。 为了定位 B9-scFv 的表位，使用 IMAC（固定金属亲和层析）分析纯化 SARS-CoV-2 的 S 亚基、S1、S2 和 S1 受体结合域 (RBD)。 为了研究抗体结合的机制，进行了差示氢-氘交换质谱（MS）。

结果

从 SARS-CoV-2 天然重链文库中分离出一种具有广泛反应性的超长 scFv (B9-scFv) CDRH3 表位，该表位显示与 SARS-CoV-2 RBD、所有 SARS-CoV-2 相关变体 (VOC) 和 SARS-CoV RBD 结合。 该表位中和了 SARS-CoV-S 假型病毒，但不是通过与 ACE2（血管紧张素转换酶 2）受体结合竞争。

相反，表位中和了假型 SARS-CoV LV，这些假型 SARS-CoV LV 可通过 S 蛋白在结构域之间的移动而短暂获得，并破坏预融合复合物的稳定性。 该表位定位于 RBD 内表面的一个隐秘裂缝，该位置与一些广泛的抗 SARS-CoV-2 抗体（如 S2H97、7D6/6D6 和 FD20）的足迹重叠。

具有广泛活性的 CDRH3 是从一个适度的序列多样性文库中分离出来的，这突显了牛系统作为获得广泛活性抗体的来源的巨大潜力，这些抗体可以提供针对新型病原生物及其突变变体的保护。 B9-scFv 占单次 S 蛋白结合选择后从 LV 转导的 293T 细胞获得的 scFv 的 53%，进一步富集 FC 后，该比例增加至 83%。 结果表明，B9-scFv 在很大程度上负责文库中的抗 S 活性。

瞬时表达 B9-scFv 的细胞显示与 S、RBD 和 S1 结合，但不与 S2 结合，表明 B9-scFv 结合位点位于 RBD 氨基酸残基 319 至 591。B9-scFv 与 S 蛋白转染细胞的结合呈浓度依赖性，并且与超长 scFv 对照相比富集。

值得注意的是，B9-scFv 与未转染的细胞没有反应性，即使浓度在一小时内达到 5 mM，这强烈表明存在特定的 S-Ab 相互作用。 B9-scFv-S 结合通过 SARS-CoV-2 VOC（如 Beta、Alpha、Delta、Gamma、Omicron 和 Gamma）中的 N501Y、D614G、Y453F、E484K、K417N 和 L452R 等突变维持。 结果表明 B9 和 scFv 之间存在广泛的交叉反应性。

与 SARS-CoV-2 变体 RBD 的结合亲和力与野生型 (wt) S 相当，支持 B9 scFv 与高度靶向和保守表位结合的观察结果。 靶向 SARS 的人 CR3022 scFv 和 B9 scFv 与中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV) RBD 相对无反应，表明 B9 scFv 具有 SARS-CoV 特异性。

B9-scFv 与 200 nM 和 2.0 μM SARS-CoV RBD 的结合仅观察到轻微差异，表明具有纳摩尔级的结合亲和力。 B9-scFv 几乎完全 (98%) 中和了浓度为 70 μg/ml 的 SARS-CoV S（Urbani 株）假型化的 LV 颗粒，但在同等 SARS-CoV-2 滴度下没有显示出这种效果。 B9-scFv 中和假型 SARS-CoV LV 的半数最大抑制浓度 (IC50) 为 468 nM。

总体而言，研究结果强调了体外表达的具有超长 CDRH3 的牛抗体在分离新颖且广泛有效的治疗方法以对抗新出现的病原微生物及其变体以及确定疫苗开发的主要表位方面的潜力。 该团队支持之前发表的研究结果，即超长 CDRH3 区域与相对不变的 Vλ 轻链配对，创建一个可以在其上克隆和表达超长重链文库的 scFv 模板。

参考：

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675