Дисплей с дрожди за генериране на специфични за SARS-CoV-2 RBD нанотела

Дисплей с дрожди за генериране на специфични за SARS-CoV-2 RBD нанотела

В скорошно проучване, публикувано в iScience Изследователите са разработили бипаратопни нанотела срещу тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

фон

Въпреки бързото разработване на ефективни и безопасни ваксини срещу SARS-CoV-2, остават въпроси относно тяхната дългосрочна ефективност, което оправдава продължаващото търсене на нови терапевтични стратегии. Рекомбинантните протеинови биологични продукти като моноклонални антитела (mAbs) предлагат потенциал за профилактика и лечение на заразени индивиди.

В допълнение, нанотелата, антителата, съдържащи единичен променлив домен, са местни за семейството на камилите. Малкият размер, високата стабилност и простата архитектура на нанотелата са с предимство пред конвенционалните mAbs. Те позволяват подобрено проникване в тъканите и са склонни да се свързват с малки епитопи с висок афинитет. В допълнение, нанотелата могат да бъдат ковалентно свързани за подобряване на функционалността и обикновено имат по-високи добиви и по-ниски производствени разходи.

Проучването и резултатите

В настоящото изследване изследователите изолират нанотела срещу рецепторния свързващ домейн (RBD) на пика на SARS-CoV-2, използвайки библиотека със синтетични дрожди. RBD бяха приготвени в два формата - 1) RBD мономер с AVI маркер за биотинилиране и 2) димерен RBD-Fc, в който RBD беше слят с кристализиращия фрагмент (Fc) домен на миши IgG1.

RBD сондите бяха валидирани чрез преходна трансфекция на 293Т клетки с човешки ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (hACE2) и оцветени с тетрамеризирани RBD мономери. Авторите откриха ACE2-зависимо свързване на RBD сонди към 293T клетки, потвърждавайки тяхната функционална цялост. Тези тетрамери бяха използвани за генериране на RBD-специфични неутрализиращи нанотела от библиотека за показване на дрожди.

Селекцията включва две последователни стъпки на магнитно обогатяване, последвано от обогатяване на базата на флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране (FACS), което води до библиотека с приблизително 72% RBD-свързващи клонове на дрожди. След това библиотеката беше оцветена съвместно с RBD тетрамери на SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, като се получиха различни популации.

Една популация (основна популация) свързва изключително SARS-CoV-2 RBD тетрамер, докато другата (второстепенна) популация свързва RBD тетрамер на двата вируса. Вероятно кръстосано реактивните SARS-CoV-1/2 клонове могат да имат запазен RBD епитоп, който представлява важна цел. След това клоновете бяха сортирани по единични клетки и първите десет клона с най-яркото RBD тетрамерно оцветяване бяха секвенирани.

Експресионните вектори на бозайници бяха клонирани с ДНК на RBD-специфични нанотела и нанотелата бяха пречистени. Авторите са тествали дали пречистените нанотела инхибират взаимодействието ACE2-RBD, използвайки тест за неутрализиране на сурогатен вирус (sVNT) и са открили четири клона на нанотела (A11, B1, C8 и G8), които инхибират свързването. Трябва да се отбележи, че само нанотялото на G8 е кръстосано реагиращо със SARS-CoV-1/2.

Капацитетът на свързване на RBD на клоновете на нанотелата беше оценен с помощта на повърхностен плазмонен резонанс (SPR). Четирите нанотела свързват SARS-CoV-2 RBD с умерен афинитет, докато само G8 свързва SARS-CoV-1 RBD, макар и с намален афинитет. По-нататъшни експерименти, базирани на SPR, разкриха два различни режима на свързване – единият включваше свързване към общ епитоп (за конструкции A11, B1 и C8), а другият към различен епитоп (G8), който беше по-консервативен в SARS-CoV-1 RBD.

Въпреки че нанотелата имат умерен афинитет, е малко вероятно те да неутрализират силно инфекцията в сравнение с използваните множество моноклонални антитела с висок афинитет. Ето защо изследователите създадоха серия от конструкции на нанотела, за да увеличат капацитета за неутрализиране на мономерите на нанотелата. Използвани са клоновете на нанотела с най-висок афинитет (G8 и B1). Тези експерименти за подобряване включват три различни стратегии.

Първо, човешки IgG1 Fc домен беше слят с нанотелата (B1-Fc и G8-Fc конструкти). Второ, B1 и G8 бяха ковалентно свързани чрез линкер глицин-серин (GS) (бипаратопни конструкции). Бипаратопните (BP) конструкции бяха генерирани с три различни дължини на линкер (10, 19 и 39 аминокиселини). Трето, димерни бипаратопни конструкции бяха генерирани с помощта на човешки IgG1 Fc домени. Извършен е анализ на микронеутрализиране, за да се провери дали конструктите инхибират инфекцията SARS-CoV-2.

Като мономери, B1 и G8 умерено инхибират инфекцията; Въпреки това, Fc димеризацията на двете нанотела подобрява тяхната неутрализираща активност. По-специално, мономерните бипаратопни конструкции значително подобряват неутрализацията и се увеличават с дължината на линкера. Fc димеризацията на бипаратопни конструкции води до мощна неутрализираща активност; Те обаче са по-малко ефективни от техните мономерни аналози.

Освен това, бипаратопните нанотела бяха тествани с помощта на мултиплексен RBD вариантен масив, за да се оцени тяхната способност да преодолеят изтичането на вирус. Бяха измерени свързването на нанотела с RBDs на вариантите на проблем SARS-CoV-2 (VOCs) и инхибирането на RBD-ACE2. Конструкцията G8-Fc се свързва с висока ефективност към всички тествани варианти, но B1-Fc нанотялото показва намалено свързване към бета и гама вариантни RBDs, както и тези, съдържащи E484D, E484K, Q493K и S494P замествания.

Независимо от това, бипаратопното нанотяло с линкер от 10 аминокиселини (BP10) има подобен профил на G8-Fc. Инхибирането на взаимодействието RBD-ACE2 беше тествано в sVNT на базата на топчета, използвайки 20 различни RBD, включително тези от SARS-CoV-1, коронавирусите на прилепи и панголини и вариантите Omicron BA.1 и BA.2.

Резултатите бяха подобни на тези от мултиплексния масив. Конструкциите на нанотелата обаче не успяха да неутрализират вариантите на Omicron. Накрая, мишките бяха третирани отделно с B1-Fc, G8-Fc и BP10-Fc конструкции и заразени със SARS-CoV-2 след 24 часа. Лечението с G8-Fc умерено намалява вирусния товар в белите дробове. Обратно, мишки, третирани с B1-Fc или BP10-Fc, са напълно защитени.

Изводи

В обобщение, проучването демонстрира изолирането на SARS-CoV-2 неутрализиращи нанотела с помощта на библиотека за показване на дрожди и че генерирането на бипаратопни нанотела очевидно може да подобри тяхната неутрализираща ефективност поради кръстосаното свързване на различни шипове протеини. Интересното е, че димеризацията на бипаратопните конструкции не успя да подобри неутрализацията в сравнение с техните мономерни аналози.

Справка:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310