Kvasinkový displej pro generování nanobody specifických pro SARS-CoV-2 RBD

Kvasinkový displej pro generování nanobody specifických pro SARS-CoV-2 RBD

V nedávné studii publikované v iScience Vědci vyvinuli biparatopické nanoprotilátky proti těžkému akutnímu respiračnímu syndromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

pozadí

Navzdory rychlému vývoji účinných a bezpečných vakcín proti SARS-CoV-2 zůstávají otázky týkající se jejich dlouhodobé účinnosti, což ospravedlňuje pokračující hledání nových terapeutických strategií. Rekombinantní proteinové biologické látky, jako jsou monoklonální protilátky (mAb), nabízejí potenciál pro profylaxi a léčbu infikovaných jedinců.

Kromě toho nanoprotilátky, protilátky obsahující jednu variabilní doménu, jsou nativní pro rodinu velbloudovitých. Malá velikost, vysoká stabilita a jednoduchá architektura nanoprotilátek jsou výhodné oproti běžným mAb. Ty umožňují zlepšenou penetraci do tkáně a mají tendenci se vázat na malé epitopy s vysokou afinitou. Kromě toho mohou být nanoprotilátky kovalentně spojeny pro zlepšení funkčnosti a obvykle mají vyšší výtěžky a nižší výrobní náklady.

Studie a výsledky

V této studii vědci izolovali nanoprotilátky proti doméně vázající receptor (RBD) špičky SARS-CoV-2 pomocí syntetické knihovny zobrazení kvasinek. RBD byly připraveny ve dvou formátech - 1) monomer RBD s AVI tagem pro biotinylaci a 2) dimerní RBD-Fc, ve kterém bylo RBD fúzováno s fragmentem krystalizovatelným (Fc) doménám myšího IgG1.

Sondy RBD byly validovány přechodnou transfekcí buněk 293T lidským enzymem konvertujícím angiotensin 2 (hACE2) a obarveny tetramerizovanými monomery RBD. Autoři zjistili vazbu sond RBD na 293T buňky závislou na ACE2, což potvrzuje jejich funkční integritu. Tyto tetramery byly použity ke generování RBD-specifických neutralizačních nanoprotilátek z kvasinkové zobrazovací knihovny.

Selekce zahrnovala dva po sobě jdoucí kroky magnetického obohacení, po nichž následovalo obohacení na základě fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS), což vedlo ke knihovně s přibližně 72 % kvasinkových klonů vázajících RBD. Dále byla knihovna společně obarvena s RBD tetramery SARS-CoV-1 a SARS-CoV-2, čímž byly získány odlišné populace.

Jedna populace (hlavní populace) vázala výhradně SARS-CoV-2 RBD tetramer, zatímco druhá (minoritní) populace vázala RBD tetramer obou virů. Je pravděpodobné, že zkříženě reaktivní klony SARS-CoV-1/2 mohou mít konzervovaný epitop RBD, který představuje důležitý cíl. Dále byly klony tříděny podle jednotlivých buněk a bylo sekvenováno prvních deset klonů s nejjasnějším barvením tetrameru RBD.

Savčí expresní vektory byly klonovány s DNA RBD-specifických nanoprotilátek a nanoprotilátky byly purifikovány. Autoři testovali, zda purifikované nanoprotilátky inhibovaly interakci ACE2-RBD pomocí testu neutralizace náhradního viru (sVNT) a našli čtyři klony nanoprotilátek (A11, B1, C8 a G8), které inhibovaly vazbu. Je pozoruhodné, že pouze nanoprotilátka G8 byla zkříženě reaktivní se SARS-CoV-1/2.

Vazebná kapacita RBD klonů nanoprotilátek byla hodnocena pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR). Čtyři nanoprotilátky vázaly SARS-CoV-2 RBD se střední afinitou, zatímco pouze G8 vázala SARS-CoV-1 RBD, i když se sníženou afinitou. Další experimenty založené na SPR odhalily dva různé vazebné režimy – jeden zahrnoval vazbu ke společnému epitopu (pro konstrukty A11, B1 a C8) a druhý k odlišnému epitopu (G8), který byl více konzervovaný v SARS-CoV-1 RBD.

Ačkoli nanoprotilátky měly střední afinity, bylo nepravděpodobné, že by silně neutralizovaly infekci ve srovnání s vícenásobnými použitými vysokoafinitními mAb. Proto výzkumníci vytvořili řadu konstruktů nanobody ke zvýšení neutralizační kapacity monomerů nanobody. Byly použity klony nanoprotilátek s nejvyššími afinitami (G8 a B1). Tyto experimenty na zlepšení zahrnovaly tři různé strategie.

Nejprve byla lidská IgG1 Fc doména fúzována k nanoprotilátkám (B1-Fc a G8-Fc konstrukty). Za druhé, B1 a G8 byly kovalentně spojeny prostřednictvím glycin-serinového (GS) linkeru (biparatopické konstrukty). Biparatopické (BP) konstrukty byly vytvořeny se třemi různými délkami linkeru (10, 19 a 39 aminokyselin). Za třetí byly vytvořeny dimerní biparatopické konstrukty s použitím lidských IgG1 Fc domén. Byl proveden mikroneutralizační test, aby se otestovalo, zda konstrukty inhibují infekci SARS-CoV-2.

Jako monomery B1 a G8 středně inhibovaly infekci; Fc dimerizace obou nanoprotilátek však zlepšila jejich neutralizační aktivitu. Je pozoruhodné, že monomerní biparatopické konstrukty významně zvýšily neutralizaci a zvýšily se s délkou linkeru. Fc dimerizace biparatopických konstruktů vedla k silné neutralizační aktivitě; Byly však méně účinné než jejich monomerní protějšky.

Dále byly biparatopické nanoprotilátky testovány pomocí multiplexního pole variant RBD, aby se vyhodnotila jejich schopnost překonat únik viru. Byla měřena vazba nanoprotilátek na RBD variant SARS-CoV-2 vzbuzujících obavy (VOC) a inhibice RBD-ACE2. Konstrukt G8-Fc se vázal s vysokou účinností na všechny testované varianty, ale nanoprotilátka B1-Fc vykazovala sníženou vazbu na beta a gama variantní RBD, stejně jako ty, které obsahují substituce E484D, E484K, Q493K a S494P.

Nicméně biparatopická nanoprotilátka s 10-aminokyselinovým linkerem (BP10) měla podobný profil jako G8-Fc. Inhibice interakce RBD-ACE2 byla testována v sVNT na bázi perliček s použitím 20 různých RBD, včetně těch ze SARS-CoV-1, netopýřích a pangolinových koronavirů a variant Omicron BA.1 a BA.2.

Výsledky byly podobné jako u multiplexního pole. Konstrukty nanobody však nebyly schopny neutralizovat varianty Omicron. Nakonec byly myši odděleně ošetřeny konstrukty B1-Fc, G8-Fc a BP10-Fc a infikovány SARS-CoV-2 po 24 hodinách. Léčba pomocí G8-Fc mírně snížila virovou zátěž v plicích. Naproti tomu myši ošetřené B1-Fc nebo BP10-Fc byly zcela chráněny.

Závěry

Stručně řečeno, studie prokázala izolaci nanoprotilátek neutralizujících SARS-CoV-2 pomocí kvasinkové zobrazovací knihovny a že vytvoření biparatopických nanoprotilátek by zjevně mohlo zlepšit jejich neutralizační účinnost díky zesíťování různých spike proteinů. Je zajímavé, že dimerizace biparatopických konstruktů nedokázala zvýšit neutralizaci ve srovnání s jejich monomerními protějšky.

Odkaz:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310