Gærdisplay til generering af SARS-CoV-2 RBD-specifikke nanobodies

Gærdisplay til generering af SARS-CoV-2 RBD-specifikke nanobodies

I en nylig undersøgelse offentliggjort i iScience Forskere har udviklet biparatopiske nanobodies mod alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

baggrund

På trods af den hurtige udvikling af effektive og sikre vacciner mod SARS-CoV-2, er der stadig spørgsmål vedrørende deres langsigtede effektivitet, hvilket retfærdiggør den fortsatte søgen efter nye terapeutiske strategier. Biologiske rekombinante proteiner såsom monoklonale antistoffer (mAbs) tilbyder potentiale til profylakse og behandling af inficerede individer.

Derudover er nanobodies, antistoffer indeholdende et enkelt variabelt domæne, hjemmehørende i kamelfamilien. Den lille størrelse, høje stabilitet og enkle arkitektur af nanobodies er fordelagtige i forhold til konventionelle mAbs. Disse muliggør forbedret indtrængning i væv og har tendens til at binde til små epitoper med høj affinitet. Derudover kan nanobodies kobles kovalent for at forbedre funktionaliteten og har typisk højere udbytte og lavere produktionsomkostninger.

Undersøgelsen og resultaterne

I denne undersøgelse isolerede forskere nanobodies mod receptorbindingsdomænet (RBD) af SARS-CoV-2-spidsen ved hjælp af et syntetisk gærdisplaybibliotek. RBD'er blev fremstillet i to formater - 1) RBD-monomer med et AVI-mærke til biotinylering og 2) dimer RBD-Fc, hvor RBD'en blev fusioneret til det fragmentkrystalliserbare (Fc) domæne af muse-IgG1.

RBD-proberne blev valideret ved forbigående transfektion af 293T-celler med humant angiotensin-konverterende enzym 2 (hACE2) og farvet med tetrameriserede RBD-monomerer. Forfatterne fandt ACE2-afhængig binding af RBD-prober til 293T-celler, hvilket bekræfter deres funktionelle integritet. Disse tetramere blev brugt til at generere RBD-specifikke neutraliserende nanobodies fra et gærdisplaybibliotek.

Udvælgelsen involverede to på hinanden følgende magnetiske berigelsestrin efterfulgt af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-baseret berigelse, hvilket resulterede i et bibliotek med ca. 72% RBD-bindende gærkloner. Dernæst blev biblioteket co-farvet med RBD-tetramerer af SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, hvilket gav distinkte populationer.

En population (hovedpopulation) bandt udelukkende SARS-CoV-2 RBD-tetramer, mens den anden (mindre) population bandt RBD-tetramer af begge vira. Det er sandsynligt, at de krydsreaktive SARS-CoV-1/2-kloner kan have en konserveret RBD-epitop, som repræsenterer et vigtigt mål. Derefter blev klonerne sorteret efter enkeltceller, og de ti bedste kloner med den klareste RBD-tetramerfarvning blev sekventeret.

Pattedyrsekspressionsvektorer blev klonet med DNA fra RBD-specifikke nanobodies, og nanobodies blev oprenset. Forfatterne testede, om de oprensede nanobodies inhiberede ACE2-RBD-interaktion ved hjælp af et surrogatvirusneutraliseringsassay (sVNT) og fandt fire nanobody-kloner (A11, B1, C8 og G8), der hæmmede binding. Det er bemærkelsesværdigt, at kun G8 nanobody var krydsreaktiv med SARS-CoV-1/2.

RBD-bindingskapaciteten af ​​nanobody-klonerne blev evalueret under anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR). De fire nanobodies bandt SARS-CoV-2 RBD med moderat affinitet, mens kun G8 bandt SARS-CoV-1 RBD, dog med reduceret affinitet. Yderligere SPR-baserede eksperimenter afslørede to forskellige bindingsmåder - den ene involverede binding til en fælles epitop (for A11, B1 og C8 konstruktioner) og den anden til en anden epitop (G8), der var mere konserveret i SARS-CoV-1 RBD.

Selvom nanobodies havde moderate affiniteter, var det usandsynligt, at de kraftigt neutraliserede infektion sammenlignet med de anvendte multiple højaffinitets mAbs. Derfor skabte forskerne en række nanobody-konstruktioner for at øge neutraliseringskapaciteten af ​​nanobody-monomerer. Nanobody-klonerne med de højeste affiniteter (G8 og B1) blev brugt. Disse forbedringsforsøg omfattede tre forskellige strategier.

Først blev et humant IgG1 Fc-domæne fusioneret til nanobodies (B1-Fc- og G8-Fc-konstruktioner). For det andet blev B1 og G8 kovalent forbundet via en glycin-serin (GS) linker (biparatopiske konstruktioner). De biparatopiske (BP) konstruktioner blev genereret med tre forskellige linkerlængder (10, 19 og 39 aminosyrer). For det tredje blev dimere biparatopiske konstruktioner genereret under anvendelse af humane IgG1 Fc-domæner. En mikroneutraliseringsanalyse blev udført for at teste, om konstruktionerne hæmmede SARS-CoV-2-infektion.

Som monomerer hæmmede B1 og G8 moderat infektion; Fc-dimerisering af begge nanobodies forbedrede imidlertid deres neutraliserende aktivitet. Det er bemærkelsesværdigt, at de monomere biparatopiske konstruktioner øgede neutraliseringen signifikant og øgedes med linkerlængden. Fc-dimerisering af biparatopiske konstruktioner resulterede i kraftig neutraliserende aktivitet; Imidlertid var de mindre effektive end deres monomere modstykker.

Ydermere blev de biparatopiske nanobodies testet ved hjælp af et multipleks RBD-variantarray for at evaluere deres evne til at overvinde viruslækage. Binding af nanobodies til RBD'er af SARS-CoV-2-varianter af bekymring (VOC'er) og RBD-ACE2-hæmning blev målt. G8-Fc-konstruktionen bandt med høj styrke til alle testede varianter, men B1-Fc-nanokroppen viste reduceret binding til beta- og gammavariant-RBD'er såvel som dem, der indeholdt E484D-, E484K-, Q493K- og S494P-substitutioner.

Ikke desto mindre havde det biparatopiske nanolegeme med en 10-aminosyrelinker (BP10) en profil svarende til G8-Fc. Hæmning af RBD-ACE2-interaktionen blev testet i en perlebaseret sVNT ved hjælp af 20 forskellige RBD'er, inklusive dem fra SARS-CoV-1, flagermus og pangolin-coronavirus og Omicron BA.1 og BA.2 varianterne.

Resultaterne svarede til resultaterne af multiplex-arrayet. Imidlertid var nanobody-konstruktionerne ikke i stand til at neutralisere Omicron-varianterne. Til sidst blev musene behandlet separat med B1-Fc-, G8-Fc- og BP10-Fc-konstruktioner og inficeret med SARS-CoV-2 efter 24 timer. Behandling med G8-Fc moderat reduceret viral belastning i lungerne. I modsætning hertil var mus behandlet med B1-Fc eller BP10-Fc fuldstændigt beskyttet.

Konklusioner

Sammenfattende viste undersøgelsen isoleringen af ​​SARS-CoV-2-neutraliserende nanobodies ved hjælp af et gærdisplaybibliotek, og at genereringen af ​​biparatopiske nanobodies tilsyneladende kunne forbedre deres neutraliserende effektivitet på grund af tværbindingen af ​​forskellige spikeproteiner. Interessant nok formåede dimerisering af de biparatopiske konstruktioner ikke at forbedre neutraliseringen sammenlignet med deres monomere modstykker.

Reference:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310