Οθόνη ζύμης για τη δημιουργία νανοσωμάτων ειδικά για τον SARS-CoV-2 RBD

Οθόνη ζύμης για τη δημιουργία νανοσωμάτων ειδικά για τον SARS-CoV-2 RBD

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο iScience Ερευνητές ανέπτυξαν διπαρατοπικά νανοσώματα κατά του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

φόντο

Παρά την ταχεία ανάπτυξη αποτελεσματικών και ασφαλών εμβολίων κατά του SARS-CoV-2, παραμένουν ερωτήματα σχετικά με τη μακροπρόθεσμη αποτελεσματικότητά τους, δικαιολογώντας τη συνεχιζόμενη αναζήτηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Οι βιολογικές ουσίες ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) προσφέρουν δυνατότητες για την προφύλαξη και τη θεραπεία των μολυσμένων ατόμων.

Επιπλέον, τα νανοσώματα, αντισώματα που περιέχουν μια μοναδική μεταβλητή περιοχή, είναι εγγενή στην οικογένεια των καμηλιδών. Το μικρό μέγεθος, η υψηλή σταθερότητα και η απλή αρχιτεκτονική των νανοσωμάτων είναι πλεονεκτικά έναντι των συμβατικών mAb. Αυτά επιτρέπουν βελτιωμένη διείσδυση στον ιστό και τείνουν να δεσμεύονται σε μικρούς επιτόπους με υψηλή συγγένεια. Επιπλέον, τα νανοσώματα μπορούν να συνδεθούν ομοιοπολικά για τη βελτίωση της λειτουργικότητας και συνήθως έχουν υψηλότερες αποδόσεις και χαμηλότερο κόστος παραγωγής.

Η μελέτη και τα αποτελέσματα

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές απομόνωσαν νανοσώματα έναντι του τομέα δέσμευσης υποδοχέα (RBD) της ακίδας SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη εμφάνισης συνθετικής ζύμης. Τα RBD παρασκευάστηκαν σε δύο μορφές - 1) μονομερές RBD με ετικέτα AVI για βιοτινυλίωση και 2) διμερές RBD-Fc, στο οποίο το RBD συντήχθηκε στην κρυσταλλοποιήσιμη (Fc) περιοχή του IgG1 ποντικού.

Οι ανιχνευτές RBD επικυρώθηκαν με παροδική επιμόλυνση κυττάρων 293Τ με ανθρώπινο ένζυμο μετατροπής αγγειοτενσίνης 2 (hACE2) και χρωματίστηκαν με τετραμερισμένα μονομερή RBD. Οι συγγραφείς βρήκαν δέσμευση ανιχνευτών RBD που εξαρτάται από το ACE2 σε κύτταρα 293Τ, επιβεβαιώνοντας τη λειτουργική τους ακεραιότητα. Αυτά τα τετραμερή χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία εξουδετερωτικών νανοσωμάτων ειδικών για το RBD από μια βιβλιοθήκη εμφάνισης ζυμομύκητα.

Η επιλογή περιελάμβανε δύο διαδοχικά στάδια μαγνητικού εμπλουτισμού, ακολουθούμενα από εμπλουτισμό με βάση τη διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό (FACS), με αποτέλεσμα μια βιβλιοθήκη με περίπου 72% κλώνους ζυμομύκητα που δεσμεύουν RBD. Στη συνέχεια, η βιβλιοθήκη συν-χρωματίστηκε με τετραμερή RBD των SARS-CoV-1 και SARS-CoV-2, δίνοντας διακριτούς πληθυσμούς.

Ο ένας πληθυσμός (κύριος πληθυσμός) συνδέθηκε αποκλειστικά με τετραμερές RBD SARS-CoV-2, ενώ ο άλλος (ελάσσονας) πληθυσμός δεσμεύτηκε με τετραμερές RBD και των δύο ιών. Είναι πιθανό ότι οι διασταυρούμενοι κλώνοι SARS-CoV-1/2 μπορεί να έχουν έναν διατηρημένο επίτοπο RBD, ο οποίος αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό στόχο. Στη συνέχεια, οι κλώνοι ταξινομήθηκαν κατά μεμονωμένα κύτταρα και οι δέκα κορυφαίοι κλώνοι με την πιο φωτεινή χρώση τετραμερούς RBD αναλύθηκαν ως προς την αλληλουχία τους.

Οι φορείς έκφρασης θηλαστικών κλωνοποιήθηκαν με το DNA των ειδικών για το RBD νανοσωμάτων και τα νανοσώματα καθαρίστηκαν. Οι συγγραφείς εξέτασαν εάν τα καθαρισμένα νανοσώματα ανέστειλαν την αλληλεπίδραση ACE2-RBD χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία εξουδετέρωσης υποκατάστατου ιού (sVNT) και βρήκαν τέσσερις κλώνους νανοσωμάτων (A11, B1, C8 και G8) που ανέστειλαν τη σύνδεση. Σημειωτέον, μόνο το νανοσωματίδιο G8 ήταν διασταυρούμενη αντίδραση με τον SARS-CoV-1/2.

Η ικανότητα δέσμευσης RBD των κλώνων νανοσωμάτων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας συντονισμό επιφανειακού πλασμονίου (SPR). Τα τέσσερα νανοσώματα συνέδεσαν το SARS-CoV-2 RBD με μέτρια συγγένεια, ενώ μόνο το G8 δέσμευσε το SARS-CoV-1 RBD, αν και με μειωμένη συγγένεια. Περαιτέρω πειράματα που βασίζονται σε SPR αποκάλυψαν δύο διαφορετικούς τρόπους δέσμευσης - ο ένας περιελάμβανε δέσμευση σε κοινό επίτοπο (για κατασκευές A11, B1 και C8) και ο άλλος σε διαφορετικό επίτοπο (G8) που ήταν περισσότερο διατηρημένος εντός του SARS-CoV-1 RBD.

Αν και τα νανοσώματα είχαν μέτριες συγγένειες, ήταν απίθανο να εξουδετερώσουν έντονα τη μόλυνση σε σύγκριση με τα πολλαπλά mAb υψηλής συγγένειας που χρησιμοποιούνται. Ως εκ τούτου, οι ερευνητές δημιούργησαν μια σειρά κατασκευών νανοσωμάτων για να αυξήσουν την ικανότητα εξουδετέρωσης των μονομερών νανοσωμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν οι κλώνοι νανοσωμάτων με τις υψηλότερες συγγένειες (G8 και B1). Αυτά τα πειράματα βελτίωσης περιελάμβαναν τρεις διαφορετικές στρατηγικές.

Πρώτον, μια ανθρώπινη περιοχή IgG1 Fc συντήχθηκε με τα νανοσώματα (κατασκευάσματα B1-Fc και G8-Fc). Δεύτερον, τα Β1 και G8 συνδέθηκαν ομοιοπολικά μέσω ενός συνδέτη γλυκίνης-σερίνης (GS) (διπαρατοπικά κατασκευάσματα). Τα διπαρατοπικά κατασκευάσματα (ΒΡ) δημιουργήθηκαν με τρία διαφορετικά μήκη συνδετήρα (10, 19 και 39 αμινοξέα). Τρίτον, διμερικά διπαρατοπικά κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινες περιοχές IgG1 Fc. Πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία μικροεξουδετέρωσης για να ελεγχθεί εάν τα κατασκευάσματα ανέστειλαν τη μόλυνση από SARS-CoV-2.

Ως μονομερή, τα Β1 και G8 ανέστειλαν μέτρια τη μόλυνση. Ωστόσο, ο διμερισμός Fc και των δύο νανοσωμάτων βελτίωσε την εξουδετερωτική τους δράση. Συγκεκριμένα, τα μονομερή διπαρατοπικά κατασκευάσματα ενίσχυσαν σημαντικά την εξουδετέρωση και αυξάνονταν με το μήκος του συνδέτη. Ο διμερισμός Fc των διπαρατοπικών κατασκευών οδήγησε σε ισχυρή εξουδετερωτική δράση. Ωστόσο, ήταν λιγότερο αποτελεσματικά από τα αντίστοιχα μονομερή τους.

Επιπλέον, τα διπαρατοπικά νανοσώματα δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μια συστοιχία παραλλαγής πολλαπλών RBD για να αξιολογηθεί η ικανότητά τους να ξεπερνούν τη διαρροή του ιού. Μετρήθηκε η δέσμευση νανοσωμάτων σε RBD παραλλαγών ανησυχίας SARS-CoV-2 (VOCs) και η αναστολή RBD-ACE2. Το κατασκεύασμα G8-Fc συνδέθηκε με υψηλή ισχύ σε όλες τις παραλλαγές που δοκιμάστηκαν, αλλά το νανοσώμα B1-Fc έδειξε μειωμένη δέσμευση σε βήτα και γάμμα παραλλαγή RBD καθώς και σε εκείνα που περιέχουν υποκαταστάσεις E484D, E484K, Q493K και S494P.

Ωστόσο, το διπαρατοπικό νανοσώμα με συνδέτη 10 αμινοξέων (BP10) είχε παρόμοιο προφίλ με το G8-Fc. Η αναστολή της αλληλεπίδρασης RBD-ACE2 δοκιμάστηκε σε ένα sVNT που βασίζεται σε σφαιρίδια χρησιμοποιώντας 20 διαφορετικά RBD, συμπεριλαμβανομένων εκείνων από κορωνοϊούς SARS-CoV-1, νυχτερίδων και παγκολίνου και τις παραλλαγές Omicron BA.1 και BA.2.

Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με αυτά της συστοιχίας πολυπλεξίας. Ωστόσο, οι κατασκευές nanobody δεν ήταν σε θέση να εξουδετερώσουν τις παραλλαγές Omicron. Τέλος, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ξεχωριστή αγωγή με κατασκευάσματα B1-Fc, G8-Fc και BP10-Fc και μολύνθηκαν με SARS-CoV-2 μετά από 24 ώρες. Θεραπεία με G8-Fc μέτρια μειωμένο ιικό φορτίο στους πνεύμονες. Αντίθετα, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με B1-Fc ή BP10-Fc ήταν πλήρως προστατευμένα.

συμπεράσματα

Συνοπτικά, η μελέτη έδειξε την απομόνωση νανοσωμάτων εξουδετέρωσης του SARS-CoV-2 με χρήση βιβλιοθήκης εμφάνισης ζυμομύκητα και ότι η δημιουργία διπαρατοπικών νανοσωμάτων θα μπορούσε προφανώς να βελτιώσει την εξουδετερωτική τους αποτελεσματικότητα λόγω της διασύνδεσης διαφορετικών πρωτεϊνών αιχμής. Είναι ενδιαφέρον ότι ο διμερισμός των διπαρατοπικών κατασκευών απέτυχε να ενισχύσει την εξουδετέρωση σε σύγκριση με τα μονομερή αντίστοιχά τους.

Αναφορά:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310