Pantalla de levadura para generar nanocuerpos específicos de RBD del SARS-CoV-2

Pantalla de levadura para generar nanocuerpos específicos de RBD del SARS-CoV-2

En un estudio reciente publicado en iCiencia Los investigadores han desarrollado nanocuerpos biparatópicos contra el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

fondo

A pesar del rápido desarrollo de vacunas eficaces y seguras contra el SARS-CoV-2, persisten dudas sobre su eficacia a largo plazo, lo que justifica la búsqueda continua de nuevas estrategias terapéuticas. Los productos biológicos de proteínas recombinantes, como los anticuerpos monoclonales (mAb), ofrecen potencial para la profilaxis y el tratamiento de personas infectadas.

Además, los nanocuerpos, anticuerpos que contienen un único dominio variable, son nativos de la familia de los camélidos. El pequeño tamaño, la alta estabilidad y la arquitectura simple de los nanocuerpos son ventajosos sobre los mAb convencionales. Estos permiten una mejor penetración en el tejido y tienden a unirse a pequeños epítopos con alta afinidad. Además, los nanocuerpos pueden unirse covalentemente para mejorar la funcionalidad y, por lo general, tienen mayores rendimientos y menores costos de producción.

El estudio y los resultados.

En el presente estudio, los investigadores aislaron nanocuerpos contra el dominio de unión al receptor (RBD) del pico del SARS-CoV-2 utilizando una biblioteca de visualización de levadura sintética. Los RBD se prepararon en dos formatos: 1) monómero RBD con una etiqueta AVI para biotinilación y 2) RBD-Fc dimérico, en el que el RBD se fusionó con el dominio cristalizable (Fc) del fragmento de IgG1 de ratón.

Las sondas RBD se validaron mediante transfección transitoria de células 293T con enzima convertidora de angiotensina 2 humana (hACE2) y se tiñeron con monómeros RBD tetramerizados. Los autores encontraron la unión dependiente de ACE2 de las sondas RBD a las células 293T, lo que confirma su integridad funcional. Estos tetrámeros se utilizaron para generar nanocuerpos neutralizantes específicos de RBD a partir de una biblioteca de presentación de levadura.

La selección implicó dos pasos consecutivos de enriquecimiento magnético, seguidos de un enriquecimiento basado en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), lo que dio como resultado una biblioteca con aproximadamente un 72 % de clones de levadura que se unen a RBD. A continuación, la biblioteca se tiñó conjuntamente con tetrámeros RBD de SARS-CoV-1 y SARS-CoV-2, lo que produjo poblaciones distintas.

Una población (población principal) se unió exclusivamente al tetrámero RBD del SARS-CoV-2, mientras que la otra población (menor) se unió al tetrámero RBD de ambos virus. Es probable que los clones de SARS-CoV-1/2 con reacción cruzada tengan un epítopo RBD conservado, que representa un objetivo importante. A continuación, los clones se clasificaron por células individuales y se secuenciaron los diez clones principales con la tinción del tetrámero RBD más brillante.

Se clonaron vectores de expresión de mamíferos con el ADN de nanocuerpos específicos de RBD y los nanocuerpos se purificaron. Los autores probaron si los nanocuerpos purificados inhibían la interacción ACE2-RBD utilizando un ensayo de neutralización de virus sustituto (sVNT) y encontraron cuatro clones de nanocuerpos (A11, B1, C8 y G8) que inhibían la unión. En particular, sólo el nanocuerpo G8 tuvo reacción cruzada con el SARS-CoV-1/2.

La capacidad de unión a RBD de los clones de nanocuerpos se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Los cuatro nanocuerpos se unieron al RBD del SARS-CoV-2 con afinidad moderada, mientras que solo el G8 se unieron al RBD del SARS-CoV-1, aunque con afinidad reducida. Otros experimentos basados ​​en SPR revelaron dos modos de unión diferentes: uno implicaba la unión a un epítopo común (para las construcciones A11, B1 y C8) y el otro a un epítopo diferente (G8) que estaba más conservado dentro del RBD del SARS-CoV-1.

Aunque los nanocuerpos tenían afinidades moderadas, era poco probable que neutralizaran fuertemente la infección en comparación con los múltiples mAb de alta afinidad utilizados. Por lo tanto, los investigadores crearon una serie de construcciones de nanocuerpos para aumentar la capacidad de neutralización de los monómeros de nanocuerpos. Se utilizaron los clones de nanocuerpos con mayores afinidades (G8 y B1). Estos experimentos de mejora incluyeron tres estrategias diferentes.

Primero, se fusionó un dominio Fc de IgG1 humana a los nanocuerpos (construcciones B1-Fc y G8-Fc). En segundo lugar, B1 y G8 se unieron covalentemente mediante un conector de glicina-serina (GS) (construcciones biparatópicas). Las construcciones biparatópicas (BP) se generaron con tres longitudes de conector diferentes (10, 19 y 39 aminoácidos). En tercer lugar, se generaron construcciones biparatópicas diméricas utilizando dominios Fc de IgG1 humana. Se realizó un ensayo de microneutralización para probar si las construcciones inhibían la infección por SARS-CoV-2.

Como monómeros, B1 y G8 inhibieron moderadamente la infección; Sin embargo, la dimerización Fc de ambos nanocuerpos mejoró su actividad neutralizante. En particular, las construcciones biparatópicas monoméricas mejoraron significativamente la neutralización y aumentaron con la longitud del conector. La dimerización con Fc de construcciones biparatópicas dio como resultado una potente actividad neutralizante; Sin embargo, fueron menos efectivos que sus homólogos monómeros.

Además, los nanocuerpos biparatópicos se probaron utilizando una matriz de variantes de RBD múltiple para evaluar su capacidad para superar la fuga de virus. Se midieron la unión de nanocuerpos a RBD de variantes preocupantes (COV) del SARS-CoV-2 y la inhibición de RBD-ACE2. La construcción G8-Fc se unió con alta potencia a todas las variantes probadas, pero el nanocuerpo B1-Fc mostró una unión reducida a los RBD variantes beta y gamma, así como a aquellos que contienen sustituciones E484D, E484K, Q493K y S494P.

Sin embargo, el nanocuerpo biparatópico con un conector de 10 aminoácidos (BP10) tenía un perfil similar al G8-Fc. La inhibición de la interacción RBD-ACE2 se probó en un sVNT basado en cuentas utilizando 20 RBD diferentes, incluidos los de los coronavirus SARS-CoV-1, murciélago y pangolín, y las variantes Omicron BA.1 y BA.2.

Los resultados fueron similares a los de la matriz multiplex. Sin embargo, las construcciones de nanocuerpos no pudieron neutralizar las variantes de Omicron. Finalmente, los ratones fueron tratados por separado con construcciones B1-Fc, G8-Fc y BP10-Fc y se infectaron con SARS-CoV-2 después de 24 horas. El tratamiento con G8-Fc redujo moderadamente la carga viral en los pulmones. Por el contrario, los ratones tratados con B1-Fc o BP10-Fc quedaron completamente protegidos.

Conclusiones

En resumen, el estudio demostró el aislamiento de nanocuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 utilizando una biblioteca de visualización de levadura y que la generación de nanocuerpos biparatópicos aparentemente podría mejorar su eficacia neutralizante debido al entrecruzamiento de diferentes proteínas de pico. Curiosamente, la dimerización de las construcciones biparatópicas no logró mejorar la neutralización en comparación con sus contrapartes monoméricas.

Referencia:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310