Pärmiekraan SARS-CoV-2 RBD-spetsiifiliste nanokehade genereerimiseks

Pärmiekraan SARS-CoV-2 RBD-spetsiifiliste nanokehade genereerimiseks

aastal avaldatud hiljutises uuringus iScience Teadlased on välja töötanud biparatoopilised nanokehad raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) vastu.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

taustal

Vaatamata SARS-CoV-2 vastaste tõhusate ja ohutute vaktsiinide kiirele arengule, on nende pikaajalise tõhususe kohta endiselt küsimusi, mis õigustavad uute ravistrateegiate otsimist. Rekombinantsed valgubioloogid, nagu monoklonaalsed antikehad (mAb), pakuvad potentsiaali nakatunud isikute profülaktikaks ja raviks.

Lisaks on nanokehad, üht muutuvat domeeni sisaldavad antikehad, kaamellaste perekonna natiivsed. Nanokehade väike suurus, kõrge stabiilsus ja lihtne arhitektuur on tavapäraste mAb-de ees eelised. Need võimaldavad paremat tungimist kudedesse ja kipuvad seonduma väikeste kõrge afiinsusega epitoopidega. Lisaks saab nanokehi funktsionaalsuse parandamiseks kovalentselt siduda ning neil on tavaliselt suurem saagikus ja madalamad tootmiskulud.

Uuring ja tulemused

Käesolevas uuringus eraldasid teadlased nanokehad SARS-CoV-2 piigi retseptori sidumisdomeeni (RBD) vastu, kasutades sünteetilise pärmi kuvamise raamatukogu. RBD-d valmistati kahes vormingus - 1) RBD monomeer koos AVI märgisega biotinüülimiseks ja 2) dimeerne RBD-Fc, milles RBD liideti hiire IgG1 fragmendi kristalliseeritava (Fc) domeeniga.

RBD sondid valideeriti 293T rakkude mööduva transfektsiooniga inimese angiotensiini konverteeriva ensüümiga 2 (hACE2) ja värviti tetrameriseeritud RBD monomeeridega. Autorid leidsid RBD sondide ACE2-sõltuva seondumise 293T rakkudega, kinnitades nende funktsionaalset terviklikkust. Neid tetrameere kasutati RBD-spetsiifiliste neutraliseerivate nanokehade genereerimiseks pärmi kuvamise raamatukogust.

Valik hõlmas kahte järjestikust magnetilise rikastamise etappi, millele järgnes fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimisel (FACS) põhinev rikastamine, mille tulemuseks oli raamatukogu ligikaudu 72% RBD-d siduvate pärmikloonidega. Järgmisena värviti raamatukogu koos SARS-CoV-1 ja SARS-CoV-2 RBD tetrameeridega, saades erinevad populatsioonid.

Üks populatsioon (põhipopulatsioon) seondus eranditult SARS-CoV-2 RBD tetrameeriga, teine ​​(väike) populatsioon aga mõlema viiruse RBD tetrameeriga. On tõenäoline, et ristreaktiivsetel SARS-CoV-1/2 kloonidel võib olla konserveerunud RBD epitoop, mis on oluline sihtmärk. Järgmisena sorteeriti kloonid üksikute rakkude kaupa ja sekveneeriti kümme kõige eredama RBD tetrameerivärviga klooni.

Imetajate ekspressioonivektorid klooniti RBD-spetsiifiliste nanokehade DNA-ga ja nanokehad puhastati. Autorid testisid, kas puhastatud nanokehad inhibeerivad ACE2-RBD interaktsiooni, kasutades surrogaatviiruse neutraliseerimisanalüüsi (sVNT), ja leidsid neli nanokehade klooni (A11, B1, C8 ja G8), mis pärssisid seondumist. Nimelt oli ainult G8 nanokeha ristreaktiivne SARS-CoV-1/2-ga.

Nanokehade kloonide RBD sidumisvõimet hinnati pinnaplasmonresonantsi (SPR) abil. Neli nanokeha sidusid SARS-CoV-2 RBD-d mõõduka afiinsusega, samas kui ainult G8 sidus SARS-CoV-1 RBD-d, ehkki vähenenud afiinsusega. Edasised SPR-põhised katsed näitasid kahte erinevat sidumisviisi – üks hõlmas seondumist ühise epitoobiga (A11, B1 ja C8 konstruktide jaoks) ja teine ​​erineva epitoobiga (G8), mis oli SARS-CoV-1 RBD piires konserveeritum.

Kuigi nanokehadel oli mõõdukas afiinsus, ei neutraliseerinud need tõenäoliselt tugevalt nakkust võrreldes paljude kasutatud kõrge afiinsusega mAb-dega. Seetõttu lõid teadlased nanokehade konstruktsioonide seeria, et suurendada nanokehade monomeeride neutraliseerimisvõimet. Kasutati kõrgeima afiinsusega nanokehade kloone (G8 ja B1). Need parenduskatsed hõlmasid kolme erinevat strateegiat.

Esiteks liideti inimese IgG1 Fc domeen nanokehadega (B1-Fc ja G8-Fc konstruktid). Teiseks ühendati B1 ja G8 kovalentselt glütsiin-seriini (GS) linkeri kaudu (biparatoopilised konstruktid). Biparatoopilised (BP) konstruktid genereeriti kolme erineva linkeri pikkusega (10, 19 ja 39 aminohapet). Kolmandaks genereeriti dimeersed biparatoopilised konstruktid, kasutades inimese IgG1 Fc domeene. Viidi läbi mikroneutralisatsiooni test, et testida, kas konstruktid inhibeerisid SARS-CoV-2 infektsiooni.

Monomeeridena inhibeerisid B1 ja G8 mõõdukalt infektsiooni; Kuid mõlema nanokeha Fc dimerisatsioon parandas nende neutraliseerivat aktiivsust. Nimelt suurendasid monomeersed biparatoopilised konstruktsioonid märkimisväärselt neutraliseerimist ja suurendasid linkeri pikkusega. Biparatoopiliste konstruktide Fc dimerisatsioon andis tulemuseks tugeva neutraliseeriva aktiivsuse; Kuid need olid vähem tõhusad kui nende monomeeride kolleegid.

Lisaks testiti biparatoopseid nanokehi mitmekordse RBD variantide massiivi abil, et hinnata nende võimet viiruse lekkest üle saada. Mõõdeti nanokehade seondumist SARS-CoV-2 probleemsete variantide (VOC) RBD-dega ja RBD-ACE2 inhibeerimist. G8-Fc konstrukt seondus tugevalt kõigi testitud variantidega, kuid B1-Fc nanokeha seostus beeta- ja gammavariantide RBD-dega, samuti nendega, mis sisaldasid E484D, E484K, Q493K ja S494P asendusi.

Sellegipoolest oli 10-aminohappelinkeriga (BP10) biparatoopilisel nanokehal G8-Fc-ga sarnane profiil. RBD-ACE2 interaktsiooni pärssimist testiti helmestel põhinevas sVNT-s, kasutades 20 erinevat RBD-d, sealhulgas SARS-CoV-1, nahkhiirte ja pangoliini koroonaviiruste ning Omicron BA.1 ja BA.2 variante.

Tulemused olid sarnased multipleksmassiivi tulemustele. Kuid nanokehade konstruktsioonid ei suutnud Omicroni variante neutraliseerida. Lõpuks töödeldi hiiri eraldi B1-Fc, G8-Fc ja BP10-Fc konstruktidega ning nakatati 24 tunni pärast SARS-CoV-2-ga. Ravi G8-Fc-ga vähendas mõõdukalt viiruskoormust kopsudes. Seevastu B1-Fc või BP10-Fc-ga ravitud hiired olid täielikult kaitstud.

Järeldused

Kokkuvõttes näitas uuring SARS-CoV-2 neutraliseerivate nanokehade eraldamist pärmi kuvaraamatukogu abil ja seda, et biparatoopsete nanokehade genereerimine võib ilmselt parandada nende neutraliseerivat efektiivsust erinevate spike-valkude ristsidumise tõttu. Huvitav on see, et biparatoopiliste konstruktide dimeriseerimine ei suurendanud neutraliseerimist võrreldes nende monomeersete kolleegidega.

Viide:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310