Hiivanäyttö SARS-CoV-2 RBD-spesifisten nanokappaleiden luomiseen

Hiivanäyttö SARS-CoV-2 RBD-spesifisten nanokappaleiden luomiseen

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa iScience Tutkijat ovat kehittäneet biparatooppisia nano-aineita vakavaa akuuttia hengitystieoireyhtymää koronavirus 2:ta (SARS-CoV-2) vastaan.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

tausta

Huolimatta tehokkaiden ja turvallisten SARS-CoV-2-rokotteiden nopeasta kehityksestä, niiden pitkän aikavälin tehokkuudesta on edelleen kysymyksiä, mikä oikeuttaa uusien hoitostrategioiden etsimisen. Rekombinanttiproteiinibiologiat, kuten monoklonaaliset vasta-aineet (mAb:t), tarjoavat potentiaalia infektoituneiden yksilöiden ennaltaehkäisyyn ja hoitoon.

Lisäksi nanoaineet, vasta-aineet, jotka sisältävät yhden vaihtelevan domeenin, ovat natiivi kamelien perhettä. Nanokappaleiden pieni koko, korkea stabiilius ja yksinkertainen arkkitehtuuri ovat edullisia tavanomaisiin mAb:ihin verrattuna. Nämä mahdollistavat paremman tunkeutumisen kudokseen ja pyrkivät sitoutumaan pieniin epitooppeihin suurella affiniteetilla. Lisäksi nanokappaleet voidaan liittää kovalenttisesti toiminnallisuuden parantamiseksi, ja niillä on tyypillisesti suurempi saanto ja alhaisemmat tuotantokustannukset.

Tutkimus ja tulokset

Tässä tutkimuksessa tutkijat eristivät nano-aineita SARS-CoV-2-piikin reseptoria sitovaa domeenia (RBD) vastaan ​​käyttämällä synteettistä hiivan näyttökirjastoa. RBD:t valmistettiin kahdessa muodossa - 1) RBD-monomeeri, jossa oli AVI-merkki biotinylaatiota varten, ja 2) dimeerinen RBD-Fc, jossa RBD fuusioitiin hiiren IgG1:n fragmenttikiteytyvään (Fc) domeeniin.

RBD-koettimet validoitiin 293T-solujen ohimenevällä transfektiolla ihmisen angiotensiiniä konvertoivalla entsyymillä 2 (hACE2) ja värjättiin tetrameroiduilla RBD-monomeereillä. Kirjoittajat havaitsivat RBD-koettimien ACE2-riippuvaisen sitoutumisen 293T-soluihin, mikä vahvisti niiden toiminnallisen eheyden. Näitä tetrameerejä käytettiin RBD-spesifisten neutraloivien nanokappaleiden tuottamiseen hiivan näyttökirjastosta.

Valinta sisälsi kaksi peräkkäistä magneettista rikastusvaihetta, jota seurasi fluoresenssiaktivoituun solulajitteluun (FACS) perustuva rikastus, mikä johti kirjastoon, jossa oli noin 72 % RBD:tä sitovia hiivaklooneja. Seuraavaksi kirjasto värjättiin yhdessä SARS-CoV-1:n ja SARS-CoV-2:n RBD-tetrameerien kanssa, mikä tuotti erilliset populaatiot.

Yksi populaatio (pääpopulaatio) sitoutui yksinomaan SARS-CoV-2 RBD-tetrameeriin, kun taas toinen (vähäinen) populaatio sitoutui molempien virusten RBD-tetrameeriin. On todennäköistä, että ristireaktiivisilla SARS-CoV-1/2-klooneilla voi olla konservoitunut RBD-epitooppi, joka edustaa tärkeää kohdetta. Seuraavaksi kloonit lajiteltiin yksittäisten solujen mukaan ja kymmenen parasta kloonia, joilla oli kirkkain RBD-tetrameerivärjäys, sekvensoitiin.

Nisäkäsekspressiovektorit kloonattiin RBD-spesifisten nanokappaleiden DNA:lla ja nanokappaleet puhdistettiin. Kirjoittajat testasivat, estivätkö puhdistetut nanokappaleet ACE2-RBD-vuorovaikutusta käyttämällä korvikeviruksen neutralointimääritystä (sVNT), ja löysivät neljä nanokappalekloonia (A11, B1, C8 ja G8), jotka estivät sitoutumista. Erityisesti vain G8-nanokappale oli ristireaktiivinen SARS-CoV-1/2:n kanssa.

Nanobodykloonien RBD-sitoutumiskyky arvioitiin käyttämällä pintaplasmoniresonanssia (SPR). Neljä nanokehoa sitoi SARS-CoV-2 RBD:tä kohtalaisella affiniteetilla, kun taas vain G8 sitoi SARS-CoV-1 RBD:tä, vaikkakin heikentyneellä affiniteetilla. SPR-pohjaiset lisäkokeet paljastivat kaksi erilaista sitoutumismuotoa - yksi liittyi sitoutumiseen yhteiseen epitooppiin (A11-, B1- ja C8-konstruktit) ja toinen eri epitooppiin (G8), joka oli konservoituneempi SARS-CoV-1 RBD:ssä.

Vaikka nanokappaleilla oli kohtalainen affiniteetti, ne eivät todennäköisesti neutraloineet voimakkaasti infektiota verrattuna käytettyihin useisiin korkean affiniteetin mAb:ihin. Siksi tutkijat loivat sarjan nanobodikonstrukteja lisätäkseen nanobodymonomeerien neutralointikykyä. Käytettiin nanobodyklooneja, joilla oli korkeimmat affiniteetit (G8 ja B1). Nämä parannuskokeet sisälsivät kolme erilaista strategiaa.

Ensin ihmisen IgG1 Fc -domeeni fuusioitiin nanokappaleisiin (B1-Fc- ja G8-Fc-konstruktit). Toiseksi B1 ja G8 liitettiin kovalenttisesti glysiini-seriini (GS) -linkkerin kautta (biparatooppiset konstruktit). Biparatooppiset (BP) -konstruktit luotiin kolmella eri linkkeripituudella (10, 19 ja 39 aminohappoa). Kolmanneksi dimeeriset biparatooppiset konstruktit luotiin käyttämällä ihmisen IgG1 Fc-domeeneja. Suoritettiin mikroneutralisointimääritys sen testaamiseksi, estivätkö konstruktit SARS-CoV-2-infektiota.

Monomeereinä B1 ja G8 estivät kohtalaisesti infektiota; Molempien nanokappaleiden Fc-dimerointi paransi kuitenkin niiden neutraloivaa aktiivisuutta. Erityisesti monomeeriset biparatooppiset konstruktit paransivat merkittävästi neutralointia ja lisääntyivät linkkerin pituuden myötä. Biparatooppisten konstruktien Fc-dimerointi johti tehokkaaseen neutraloivaan aktiivisuuteen; Ne olivat kuitenkin vähemmän tehokkaita kuin monomeerivastineet.

Lisäksi biparatooppisia nanokappaleita testattiin käyttämällä multipleksistä RBD-varianttiryhmää arvioimaan niiden kykyä voittaa virusvuodot. Nanokappaleiden sitoutuminen huolta aiheuttavien SARS-CoV-2-varianttien (VOC) RBD-soluihin ja RBD-ACE2:n esto mitattiin. G8-Fc-konstrukti sitoutui suurella teholla kaikkiin testattuihin variantteihin, mutta B1-Fc-nanobody osoitti vähentynyttä sitoutumista beeta- ja gammavariantti-RBD:ihin sekä niihin, jotka sisälsivät E484D-, E484K-, Q493K- ja S494P-substituutioita.

Siitä huolimatta biparatooppisella nanobodylla, jossa oli 10 aminohapon linkkeri (BP10), oli samanlainen profiili kuin G8-Fc:llä. RBD-ACE2-vuorovaikutuksen esto testattiin helmipohjaisessa sVNT:ssä käyttäen 20 erilaista RBD:tä, mukaan lukien SARS-CoV-1-, lepakoiden ja pangoliinin koronaviruksista sekä Omicron BA.1- ja BA.2 -varianteista.

Tulokset olivat samanlaisia ​​kuin multipleksitaulukon tulokset. Nanobody-rakenteet eivät kuitenkaan pystyneet neutraloimaan Omicron-variantteja. Lopuksi hiiret käsiteltiin erikseen B1-Fc-, G8-Fc- ja BP10-Fc-konstrukteilla ja infektoitiin SARS-CoV-2:lla 24 tunnin kuluttua. G8-Fc-hoito vähensi kohtalaisesti viruskuormaa keuhkoissa. Sitä vastoin B1-Fc:llä tai BP10-Fc:llä käsitellyt hiiret olivat täysin suojattuja.

Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimus osoitti SARS-CoV-2:ta neutraloivien nanokappaleiden eristämisen hiivan näyttökirjaston avulla ja että biparatooppisten nanokappaleiden synnyttäminen voisi ilmeisesti parantaa niiden neutraloivaa tehokkuutta erilaisten piikkiproteiinien silloittumisen ansiosta. Mielenkiintoista on, että biparatooppisten konstruktien dimerointi ei tehostanut neutralisaatiota verrattuna niiden monomeerisiin vastineisiin.

Viite:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310