Affichage de levure pour générer des nanobodies spécifiques au SARS-CoV-2 RBD

Affichage de levure pour générer des nanobodies spécifiques au SARS-CoV-2 RBD

Dans une étude récente publiée dans iScience Les chercheurs ont développé des nanobodies biparatopiques contre le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

arrière-plan

Malgré le développement rapide de vaccins efficaces et sûrs contre le SRAS-CoV-2, des questions demeurent quant à leur efficacité à long terme, justifiant la recherche continue de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les produits biologiques protéiques recombinants tels que les anticorps monoclonaux (mAb) offrent un potentiel pour la prophylaxie et le traitement des personnes infectées.

De plus, les nanobodies, anticorps contenant un seul domaine variable, sont originaires de la famille des camélidés. La petite taille, la stabilité élevée et l’architecture simple des nanocorps sont avantageuses par rapport aux mAb conventionnels. Ceux-ci permettent une meilleure pénétration dans les tissus et ont tendance à se lier à de petits épitopes avec une affinité élevée. De plus, les nanocorps peuvent être liés de manière covalente pour améliorer la fonctionnalité et ont généralement des rendements plus élevés et des coûts de production inférieurs.

L'étude et les résultats

Dans la présente étude, les chercheurs ont isolé des nanocorps contre le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la pointe du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une bibliothèque d’affichage de levure synthétique. Les RBD ont été préparés dans deux formats : 1) monomère RBD avec une étiquette AVI pour la biotinylation et 2) RBD-Fc dimère, dans lequel le RBD a été fusionné au domaine fragment cristallisable (Fc) de l'IgG1 de souris.

Les sondes RBD ont été validées par transfection transitoire de cellules 293T avec l'enzyme de conversion de l'angiotensine humaine 2 (hACE2) et colorées avec des monomères RBD tétramérisés. Les auteurs ont découvert la liaison ACE2-dépendante des sondes RBD aux cellules 293T, confirmant leur intégrité fonctionnelle. Ces tétramères ont été utilisés pour générer des nanocorps neutralisants spécifiques au RBD à partir d’une bibliothèque d’affichage de levure.

La sélection impliquait deux étapes consécutives d’enrichissement magnétique, suivies d’un enrichissement basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), résultant en une bibliothèque contenant environ 72 % de clones de levure se liant au RBD. Ensuite, la bibliothèque a été co-colorée avec des tétramères RBD du SARS-CoV-1 et du SARS-CoV-2, produisant des populations distinctes.

Une population (population principale) s’est liée exclusivement au tétramère RBD du SRAS-CoV-2, tandis que l’autre population (mineure) s’est liée au tétramère RBD des deux virus. Il est probable que les clones SARS-CoV-1/2 à réaction croisée puissent avoir un épitope RBD conservé, ce qui représente une cible importante. Ensuite, les clones ont été triés par cellules individuelles et les dix premiers clones présentant la coloration tétramère RBD la plus brillante ont été séquencés.

Les vecteurs d'expression de mammifères ont été clonés avec l'ADN de nanocorps spécifiques du RBD et les nanocorps ont été purifiés. Les auteurs ont vérifié si les nanocorps purifiés inhibaient l'interaction ACE2-RBD à l'aide d'un test de neutralisation du virus de substitution (sVNT) et ont trouvé quatre clones de nanocorps (A11, B1, C8 et G8) qui inhibaient la liaison. Notamment, seul le nanocorps G8 présentait une réaction croisée avec le SRAS-CoV-1/2.

La capacité de liaison RBD des clones de nanocorps a été évaluée par résonance plasmonique de surface (SPR). Les quatre nanobodies se sont liés au SARS-CoV-2 RBD avec une affinité modérée, tandis que seul le G8 s'est lié au SARS-CoV-1 RBD, bien qu'avec une affinité réduite. D'autres expériences basées sur SPR ont révélé deux modes de liaison différents : l'un impliquait la liaison à un épitope commun (pour les constructions A11, B1 et C8) et l'autre à un épitope différent (G8) qui était mieux conservé dans le RBD du SRAS-CoV-1.

Bien que les nanobodies aient des affinités modérées, il est peu probable qu’ils neutralisent fortement l’infection par rapport aux multiples mAb de haute affinité utilisés. Par conséquent, les chercheurs ont créé une série de constructions de nanocorps pour augmenter la capacité de neutralisation des monomères de nanocorps. Les clones de nanocorps présentant les affinités les plus élevées (G8 et B1) ont été utilisés. Ces expériences d'amélioration comprenaient trois stratégies différentes.

Tout d’abord, un domaine IgG1 Fc humain a été fusionné aux nanocorps (constructions B1-Fc et G8-Fc). Deuxièmement, B1 et G8 étaient liés de manière covalente via un lieur glycine-sérine (GS) (constructions biparatopiques). Les constructions biparatopiques (BP) ont été générées avec trois longueurs de lieur différentes (10, 19 et 39 acides aminés). Troisièmement, des constructions biparatopiques dimères ont été générées à l'aide de domaines Fc IgG1 humains. Un test de microneutralisation a été réalisé pour vérifier si les constructions inhibaient l'infection par le SRAS-CoV-2.

En tant que monomères, B1 et G8 ont modérément inhibé l'infection ; Cependant, la dimérisation Fc des deux nanocorps a amélioré leur activité neutralisante. Notamment, les constructions biparatopiques monomères ont considérablement amélioré la neutralisation et augmenté avec la longueur du lieur. La dimérisation Fc des constructions biparatopiques a entraîné une puissante activité neutralisante ; Cependant, ils étaient moins efficaces que leurs homologues monomères.

En outre, les nanocorps biparatopiques ont été testés à l’aide d’un réseau de variantes multiplex RBD pour évaluer leur capacité à surmonter les fuites de virus. La liaison des nanocorps aux RBD des variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 (COV) et l’inhibition du RBD-ACE2 ont été mesurées. La construction G8-Fc s'est liée avec une puissance élevée à toutes les variantes testées, mais le nanocorps B1-Fc a montré une liaison réduite aux variantes RBD bêta et gamma ainsi qu'à ceux contenant des substitutions E484D, E484K, Q493K et S494P.

Néanmoins, le nanocorps biparatopique avec un lieur de 10 acides aminés (BP10) avait un profil similaire à celui du G8-Fc. L’inhibition de l’interaction RBD-ACE2 a été testée dans un sVNT à base de billes utilisant 20 RBD différents, y compris ceux des coronavirus du SRAS-CoV-1, des chauves-souris et du pangolin, ainsi que les variantes Omicron BA.1 et BA.2.

Les résultats étaient similaires à ceux du réseau multiplex. Cependant, les constructions de nanocorps n’ont pas pu neutraliser les variantes d’Omicron. Enfin, les souris ont été traitées séparément avec les constructions B1-Fc, G8-Fc et BP10-Fc et infectées par le SRAS-CoV-2 après 24 heures. Le traitement par G8-Fc a modérément réduit la charge virale dans les poumons. En revanche, les souris traitées avec B1-Fc ou BP10-Fc étaient complètement protégées.

Conclusions

En résumé, l’étude a démontré l’isolement des nanocorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une bibliothèque d’affichage de levure et que la génération de nanocorps biparatopiques pourrait apparemment améliorer leur efficacité neutralisante en raison de la réticulation de différentes protéines de pointe. Il est intéressant de noter que la dimérisation des constructions biparatopiques n’a pas réussi à améliorer la neutralisation par rapport à leurs homologues monomères.

Référence:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310