Prikaz kvasca za generiranje nanotijela specifičnih za SARS-CoV-2 RBD

Prikaz kvasca za generiranje nanotijela specifičnih za SARS-CoV-2 RBD

U nedavnoj studiji objavljenoj u iScience Istraživači su razvili biparatopična nanotijela protiv teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

pozadina

Unatoč brzom razvoju učinkovitih i sigurnih cjepiva protiv SARS-CoV-2, ostaje pitanje njihove dugoročne učinkovitosti, što opravdava kontinuiranu potragu za novim terapijskim strategijama. Rekombinantni proteinski biološki lijekovi kao što su monoklonska protutijela (mAbs) nude potencijal za profilaksu i liječenje zaraženih osoba.

Osim toga, nanotijela, protutijela koja sadrže jednu varijabilnu domenu, izvorna su za obitelj deva. Mala veličina, visoka stabilnost i jednostavna arhitektura nanotijela su u prednosti u odnosu na konvencionalna mAb. Oni omogućuju bolje prodiranje u tkivo i imaju tendenciju vezati se na male epitope s visokim afinitetom. Osim toga, nanotijela se mogu kovalentno povezati kako bi se poboljšala funkcionalnost i obično imaju veće prinose i niže troškove proizvodnje.

Studija i rezultati

U ovoj studiji, istraživači su izolirali nanotijela protiv receptorske vezne domene (RBD) šiljka SARS-CoV-2 koristeći biblioteku prikaza sintetičkog kvasca. RBD su pripremljeni u dva formata - 1) RBD monomer s AVI oznakom za biotinilaciju i 2) dimerni RBD-Fc, u kojem je RBD fuzioniran s domenom koja se može kristalizirati (Fc) fragmenta mišjeg IgG1.

RBD sonde su potvrđene prolaznom transfekcijom 293T stanica s ljudskim angiotenzin-konvertirajućim enzimom 2 (hACE2) i obojene tetrameriziranim RBD monomerima. Autori su pronašli ACE2-ovisno vezanje RBD sondi na 293T stanice, potvrđujući njihov funkcionalni integritet. Ovi tetrameri korišteni su za generiranje RBD-specifičnih neutralizirajućih nanotijela iz knjižnice prikaza kvasca.

Odabir je uključivao dva uzastopna koraka magnetskog obogaćivanja, nakon čega je uslijedilo obogaćivanje bazirano na fluorescentno aktiviranom sortiranju stanica (FACS), što je rezultiralo bibliotekom s približno 72% RBD-vezujućih klonova kvasca. Zatim je biblioteka obojena RBD tetramerima SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2, dajući različite populacije.

Jedna populacija (glavna populacija) vezala je isključivo SARS-CoV-2 RBD tetramer, dok je druga (manja) populacija vezala RBD tetramer oba virusa. Vjerojatno je da križno reaktivni klonovi SARS-CoV-1/2 mogu imati očuvan RBD epitop, koji predstavlja važnu metu. Zatim su klonovi razvrstani po pojedinačnim stanicama i prvih deset klonova s ​​najsvjetlijim RBD tetramerom bojenjem je sekvencirano.

Ekspresijski vektori sisavaca klonirani su s DNK RBD-specifičnih nanotijela i nanotijela su pročišćena. Autori su testirali jesu li pročišćena nanotijela inhibirala interakciju ACE2-RBD koristeći test neutralizacije surogat virusa (sVNT) i pronašli četiri klona nanotijela (A11, B1, C8 i G8) koji su inhibirali vezanje. Naime, samo je nanotijelo G8 bilo unakrsno reaktivno sa SARS-CoV-1/2.

RBD kapacitet vezanja klonova nanotijela procijenjen je pomoću površinske plazmonske rezonancije (SPR). Četiri nanotijela vezala su SARS-CoV-2 RBD s umjerenim afinitetom, dok je samo G8 vezalo SARS-CoV-1 RBD, iako sa smanjenim afinitetom. Daljnji eksperimenti temeljeni na SPR-u otkrili su dva različita načina vezanja - jedan je uključivao vezanje na zajednički epitop (za konstrukte A11, B1 i C8), a drugi na drugačiji epitop (G8) koji je bio više očuvan unutar SARS-CoV-1 RBD.

Iako su nanotijela imala umjerene afinitete, nije bilo vjerojatno da će snažno neutralizirati infekciju u usporedbi s više korištenih mAb visokog afiniteta. Stoga su istraživači stvorili niz konstrukata nanotijela kako bi povećali kapacitet neutralizacije monomera nanotijela. Korišteni su klonovi nanotijela s najvećim afinitetom (G8 i B1). Ovi eksperimenti poboljšanja uključivali su tri različite strategije.

Prvo je ljudska IgG1 Fc domena spojena s nanotijelima (B1-Fc i G8-Fc konstrukti). Drugo, B1 i G8 bili su kovalentno povezani preko glicin-serinskog (GS) povezivača (biparatopni konstrukti). Biparatopni (BP) konstrukti generirani su s tri različite duljine linkera (10, 19 i 39 aminokiselina). Treće, dimerni biparatopni konstrukti generirani su pomoću ljudskih IgG1 Fc domena. Proveden je test mikroneutralizacije kako bi se testiralo inhibiraju li konstrukti infekciju SARS-CoV-2.

Kao monomeri, B1 i G8 umjereno su inhibirali infekciju; Međutim, Fc dimerizacija obaju nanotijela poboljšala je njihovu neutralizirajuću aktivnost. Značajno je da su monomerni biparatopni konstrukti značajno pojačali neutralizaciju i povećali se s duljinom linkera. Fc dimerizacija biparatopskih konstrukata rezultirala je snažnom neutralizirajućom aktivnošću; Međutim, bili su manje učinkoviti od svojih monomernih pandana.

Nadalje, biparatopska nanotijela testirana su korištenjem multiplex RBD varijantnog niza kako bi se procijenila njihova sposobnost prevladavanja curenja virusa. Mjereno je vezanje nanotijela za RBD-ove SARS-CoV-2 inhibicije SARS-CoV-2 (VOC) i inhibicija RBD-ACE2. G8-Fc konstrukt se visoko potentno vezao za sve testirane varijante, ali B1-Fc nanotijelo pokazalo je smanjeno vezanje za beta i gama varijante RBD-ova kao i one koje sadrže supstitucije E484D, E484K, Q493K i S494P.

Unatoč tome, biparatopsko nanotijelo s veznicom od 10 aminokiselina (BP10) imalo je sličan profil kao G8-Fc. Inhibicija interakcije RBD-ACE2 testirana je u sVNT-u temeljenom na kuglicama pomoću 20 različitih RBD-ova, uključujući one iz SARS-CoV-1, koronavirusa šišmiša i pangolina te varijante Omicron BA.1 i BA.2.

Rezultati su bili slični onima za multipleks niz. Međutim, konstrukti nanotijela nisu mogli neutralizirati varijante Omikrona. Konačno, miševi su odvojeno tretirani konstruktima B1-Fc, G8-Fc i BP10-Fc i zaraženi SARS-CoV-2 nakon 24 sata. Liječenje s G8-Fc umjereno je smanjilo virusno opterećenje u plućima. Nasuprot tome, miševi tretirani s B1-Fc ili BP10-Fc bili su potpuno zaštićeni.

Zaključci

Ukratko, studija je pokazala izolaciju nanotijela koja neutraliziraju SARS-CoV-2 pomoću biblioteke prikaza kvasca i da bi stvaranje biparatopskih nanotijela očito moglo poboljšati njihovu učinkovitost neutralizacije zbog unakrsnog povezivanja različitih šiljastih proteina. Zanimljivo je da dimerizacija biparatopskih konstrukata nije uspjela poboljšati neutralizaciju u usporedbi s njihovim monomernim parnjacima.

Referenca:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310