Élesztő kijelző SARS-CoV-2 RBD-specifikus nanotestek előállításához

Élesztő kijelző SARS-CoV-2 RBD-specifikus nanotestek előállításához

Egy nemrégiben megjelent tanulmányban iScience A kutatók biparatópiás nanotesteket fejlesztettek ki a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) ellen.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

háttér

A SARS-CoV-2 elleni hatékony és biztonságos vakcinák gyors fejlődése ellenére továbbra is kérdések merülnek fel azok hosszú távú hatékonyságát illetően, ami indokolja az új terápiás stratégiák folyamatos keresését. A rekombináns fehérjebiológiák, például a monoklonális antitestek (mAb-k) lehetőséget kínálnak a fertőzött egyének megelőzésére és kezelésére.

Ezenkívül a nanotestek, az egyetlen variábilis domént tartalmazó antitestek a tevefélék családjában natívak. A nanotestek kis mérete, nagy stabilitása és egyszerű felépítése előnyösebb a hagyományos mAb-ekkel szemben. Ezek jobb behatolást tesznek lehetővé a szövetekbe, és hajlamosak nagy affinitással kis epitópokhoz kötődni. Ezenkívül a nanotestek kovalens kötéssel kapcsolhatók össze a funkcionalitás javítása érdekében, és jellemzően magasabb hozamokkal és alacsonyabb előállítási költségekkel rendelkeznek.

A tanulmány és az eredmények

Jelen tanulmányban a kutatók nanotesteket izoláltak a SARS-CoV-2 tüske receptorkötő doménje (RBD) ellen egy szintetikus élesztő-megjelenítő könyvtár segítségével. Az RBD-ket két formátumban állítottuk elő: 1) RBD monomer AVI címkével a biotinilezéshez és 2) dimer RBD-Fc, amelyben az RBD-t az egér IgG1 fragmens kristályosítható (Fc) doménjéhez fuzionáltattuk.

Az RBD-próbákat 293T-sejtek humán angiotenzin-konvertáló enzim 2-vel (hACE2) történő átmeneti transzfekciójával validáltuk, és tetramerizált RBD-monomerekkel festették. A szerzők az RBD-próbák ACE2-függő kötődését találták 293T-sejtekhez, ami megerősíti funkcionális integritásukat. Ezeket a tetramereket RBD-specifikus neutralizáló nanotestek előállítására használták élesztő-megjelenítő könyvtárból.

A szelekció két egymást követő mágneses dúsítási lépésből állt, majd ezt követte a fluoreszcenciával aktivált sejtválogatás (FACS) alapú dúsítás, ami körülbelül 72%-ban RBD-kötő élesztő klónokat tartalmazó könyvtárat eredményezett. Ezt követően a könyvtárat a SARS-CoV-1 és SARS-CoV-2 RBD tetramereivel együtt festettük, így külön populációkat kaptunk.

Az egyik populáció (főpopuláció) kizárólag a SARS-CoV-2 RBD tetramerhez, míg a másik (kisebb) populáció mindkét vírus RBD tetrameréhez kötődött. Valószínű, hogy a keresztreaktív SARS-CoV-1/2 klónok konzervált RBD epitóppal rendelkezhetnek, ami fontos célpont. Ezután a klónokat egyedi sejtek szerint válogattuk, és a tíz legfényesebb RBD-tetramer festéssel rendelkező klónt szekvenáltuk.

Az emlős expressziós vektorokat RBD-specifikus nanotestek DNS-ével klónozták, és a nanotesteket megtisztították. A szerzők egy helyettesítő vírusneutralizációs vizsgálattal (sVNT) tesztelték, hogy a tisztított nanotestek gátolják-e az ACE2-RBD kölcsönhatást, és négy nanotest klónt (A11, B1, C8 és G8) találtak, amelyek gátolják a kötődést. Figyelemre méltó, hogy csak a G8 nanotest volt keresztreaktív a SARS-CoV-1/2-vel.

A nanotest klónok RBD-kötő képességét felületi plazmonrezonancia (SPR) segítségével értékeltük. A négy nanotest mérsékelt affinitással kötötte meg a SARS-CoV-2 RBD-t, míg csak a G8 kötötte meg a SARS-CoV-1 RBD-t, bár csökkent affinitással. További SPR-alapú kísérletek két különböző kötési módot tártak fel – az egyik egy közös epitóphoz kötődött (A11, B1 és C8 konstrukciók esetén), a másik pedig egy másik epitóphoz (G8), amely konzerváltabb volt a SARS-CoV-1 RBD-n belül.

Bár a nanotestek mérsékelt affinitással rendelkeztek, nem valószínű, hogy erősen semlegesítenék a fertőzést a többszörösen használt nagy affinitású mAb-ekhez képest. Ezért a kutatók egy sor nanotest konstrukciót hoztak létre, hogy növeljék a nanotest monomerek semlegesítési kapacitását. A legnagyobb affinitással rendelkező nanotest klónokat (G8 és B1) használtuk. Ezek a fejlesztési kísérletek három különböző stratégiát tartalmaztak.

Először egy humán IgG1 Fc domént fuzionáltunk a nanotestekhez (B1-Fc és G8-Fc konstrukciók). Másodszor, a B1 és G8 kovalensen kapcsolódott glicin-szerin (GS) linkeren keresztül (biparatopikus konstrukciók). A biparatópiás (BP) konstrukciókat három különböző linkerhosszúsággal (10, 19 és 39 aminosav) hoztuk létre. Harmadszor, dimer biparatópiás konstrukciókat állítottunk elő humán IgG1 Fc domének felhasználásával. Mikroneutralizációs vizsgálatot végeztünk annak tesztelésére, hogy a konstrukciók gátolják-e a SARS-CoV-2 fertőzést.

Monomerként a B1 és G8 mérsékelten gátolta a fertőzést; Azonban mindkét nanotest Fc dimerizációja javította semlegesítő aktivitásukat. Nevezetesen, a monomer biparatopikus konstrukciók jelentősen fokozták a semlegesítést, és megnőttek a linker hosszával. A biparatópiás konstrukciók Fc dimerizációja hatékony semlegesítő aktivitást eredményezett; Ezek azonban kevésbé voltak hatékonyak, mint monomer társaik.

Ezenkívül a biparatopikus nanotesteket multiplex RBD variáns tömb segítségével tesztelték, hogy értékeljék a vírusszivárgás leküzdésére való képességüket. Mértük a nanotestek kötődését a SARS-CoV-2 aggodalomra okot adó variánsok (VOC) RBD-jéhez és az RBD-ACE2 gátlását. A G8-Fc konstrukció nagy hatékonysággal kötődött az összes vizsgált változathoz, de a B1-Fc nanotest csökkent kötődést mutatott a béta- és gamma-változatú RBD-ekhez, valamint az E484D, E484K, Q493K és S494P szubsztitúciót tartalmazókhoz.

Ennek ellenére a 10 aminosavból álló linkerrel (BP10) rendelkező biparatopikus nanotest hasonló profillal rendelkezett, mint a G8-Fc. Az RBD-ACE2 kölcsönhatás gátlását gyöngy alapú sVNT-ben tesztelték 20 különböző RBD használatával, beleértve a SARS-CoV-1, denevér és pangolin koronavírusok, valamint az Omicron BA.1 és BA.2 variánsait.

Az eredmények hasonlóak voltak a multiplex tömb eredményeihez. A nanotest-konstrukciók azonban nem tudták semlegesíteni az Omicron-változatokat. Végül az egereket külön kezeltük B1-Fc, G8-Fc és BP10-Fc konstrukciókkal, és 24 óra múlva SARS-CoV-2-vel fertőztük meg. A G8-Fc kezelés mérsékelten csökkentette a tüdő vírusterhelését. Ezzel szemben a B1-Fc-vel vagy BP10-Fc-vel kezelt egerek teljesen védettek voltak.

Következtetések

Összefoglalva, a tanulmány kimutatta a SARS-CoV-2 semlegesítő nanotestek izolálását élesztő-megjelenítő könyvtár segítségével, és hogy a biparatópiás nanotestek létrehozása nyilvánvalóan javíthatja semlegesítő hatékonyságukat a különböző tüskefehérjék keresztkötése miatt. Érdekes módon a biparatopikus konstrukciók dimerizációja nem javította a semlegesítést monomer társaikhoz képest.

Referencia:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310