Visualizzazione del lievito per la generazione di nanocorpi specifici per SARS-CoV-2 RBD

Visualizzazione del lievito per la generazione di nanocorpi specifici per SARS-CoV-2 RBD

In un recente studio pubblicato su iScienza I ricercatori hanno sviluppato nanocorpi biparatopici contro la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

sfondo

Nonostante il rapido sviluppo di vaccini efficaci e sicuri contro la SARS-CoV-2, permangono dubbi sulla loro efficacia a lungo termine, giustificando la continua ricerca di nuove strategie terapeutiche. I prodotti biologici proteici ricombinanti come gli anticorpi monoclonali (mAb) offrono potenzialità per la profilassi e il trattamento degli individui infetti.

Inoltre, i nanobodies, anticorpi contenenti un singolo dominio variabile, sono originari della famiglia dei camelidi. Le dimensioni ridotte, l’elevata stabilità e l’architettura semplice dei nanobody sono vantaggiosi rispetto ai mAb convenzionali. Questi consentono una migliore penetrazione nei tessuti e tendono a legarsi a piccoli epitopi con elevata affinità. Inoltre, i nanocorpi possono essere legati covalentemente per migliorare la funzionalità e in genere hanno rese più elevate e costi di produzione inferiori.

Lo studio e i risultati

Nel presente studio, i ricercatori hanno isolato i nanocorpi contro il dominio di legame del recettore (RBD) del picco SARS-CoV-2 utilizzando una libreria di visualizzazione di lievito sintetico. Gli RBD sono stati preparati in due formati: 1) monomero RBD con un tag AVI per la biotinilazione e 2) RBD-Fc dimerico, in cui l'RBD era fuso al dominio cristallizzabile del frammento (Fc) dell'IgG1 di topo.

Le sonde RBD sono state convalidate mediante trasfezione transitoria di cellule 293T con l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) e colorate con monomeri RBD tetramerizzati. Gli autori hanno trovato il legame ACE2-dipendente delle sonde RBD alle cellule 293T, confermando la loro integrità funzionale. Questi tetrameri sono stati utilizzati per generare nanocorpi neutralizzanti specifici dell'RBD da una libreria di visualizzazione del lievito.

La selezione ha coinvolto due fasi consecutive di arricchimento magnetico, seguite da un arricchimento basato sullo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), risultando in una libreria con circa il 72% di cloni di lievito che legano RBD. Successivamente, la libreria è stata co-colorata con i tetrameri RBD di SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, ottenendo popolazioni distinte.

Una popolazione (popolazione principale) si lega esclusivamente al tetramero RBD di SARS-CoV-2, mentre l’altra popolazione (minore) si lega al tetramero RBD di entrambi i virus. È probabile che i cloni cross-reattivi di SARS-CoV-1/2 possano avere un epitopo RBD conservato, che rappresenta un obiettivo importante. Successivamente, i cloni sono stati ordinati per singole cellule e sono stati sequenziati i primi dieci cloni con la colorazione del tetramero RBD più brillante.

I vettori di espressione dei mammiferi sono stati clonati con il DNA di nanocorpi specifici di RBD e i nanocorpi sono stati purificati. Gli autori hanno testato se i nanocorpi purificati inibivano l’interazione ACE2-RBD utilizzando un test di neutralizzazione del virus surrogato (sVNT) e hanno trovato quattro cloni di nanobody (A11, B1, C8 e G8) che inibivano il legame. In particolare, solo il nanocorpo G8 era cross-reattivo con SARS-CoV-1/2.

La capacità di legame RBD dei cloni di nanobody è stata valutata utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR). I quattro nanocorpi legano l’RBD di SARS-CoV-2 con affinità moderata, mentre solo G8 legano l’RBD di SARS-CoV-1, anche se con affinità ridotta. Ulteriori esperimenti basati su SPR hanno rivelato due diverse modalità di legame: una prevedeva il legame a un epitopo comune (per i costrutti A11, B1 e C8) e l'altro a un epitopo diverso (G8) che era più conservato all'interno del RBD SARS-CoV-1.

Sebbene i nanocorpi avessero affinità moderate, era improbabile che neutralizzassero fortemente l’infezione rispetto ai molteplici mAb ad alta affinità utilizzati. Pertanto, i ricercatori hanno creato una serie di costrutti di nanobody per aumentare la capacità di neutralizzazione dei monomeri di nanobody. Sono stati utilizzati i cloni di nanobody con le affinità più elevate (G8 e B1). Questi esperimenti di miglioramento includevano tre diverse strategie.

Innanzitutto, un dominio Fc IgG1 umano è stato fuso con i nanocorpi (costrutti B1-Fc e G8-Fc). In secondo luogo, B1 e G8 erano legati covalentemente tramite un linker glicina-serina (GS) (costrutti biparatopici). I costrutti biparatopici (BP) sono stati generati con tre diverse lunghezze del linker (10, 19 e 39 aminoacidi). In terzo luogo, i costrutti biparatopici dimerici sono stati generati utilizzando domini Fc IgG1 umani. È stata eseguita un’analisi di microneutralizzazione per verificare se i costrutti inibivano l’infezione da SARS-CoV-2.

Come monomeri, B1 e G8 hanno inibito moderatamente l’infezione; Tuttavia, la dimerizzazione Fc di entrambi i nanocorpi ha migliorato la loro attività neutralizzante. In particolare, i costrutti monomerici biparatopici migliorano significativamente la neutralizzazione e aumentano con la lunghezza del linker. La dimerizzazione Fc dei costrutti biparatopici ha prodotto una potente attività neutralizzante; Tuttavia, erano meno efficaci delle loro controparti monomeriche.

Inoltre, i nanocorpi biparatopici sono stati testati utilizzando un array di varianti multiplex RBD per valutare la loro capacità di superare la fuoriuscita di virus. Sono stati misurati il ​​legame dei nanocorpi agli RBD delle varianti problematiche di SARS-CoV-2 (COV) e l’inibizione di RBD-ACE2. Il costrutto G8-Fc si legava con elevata potenza a tutte le varianti testate, ma il nanobody B1-Fc mostrava un legame ridotto con gli RBD delle varianti beta e gamma nonché con quelli contenenti le sostituzioni E484D, E484K, Q493K e S494P.

Tuttavia, il nanobody biparatopico con un linker di 10 aminoacidi (BP10) aveva un profilo simile a G8-Fc. L’inibizione dell’interazione RBD-ACE2 è stata testata in un sVNT basato su perline utilizzando 20 diversi RBD, compresi quelli dei coronavirus SARS-CoV-1, pipistrello e pangolino e le varianti Omicron BA.1 e BA.2.

I risultati erano simili a quelli dell'array multiplex. Tuttavia, i costrutti dei nanobody non sono stati in grado di neutralizzare le varianti di Omicron. Infine, i topi sono stati trattati separatamente con i costrutti B1-Fc, G8-Fc e BP10-Fc e infettati con SARS-CoV-2 dopo 24 ore. Il trattamento con G8-Fc ha ridotto moderatamente la carica virale nei polmoni. Al contrario, i topi trattati con B1-Fc o BP10-Fc erano completamente protetti.

Conclusioni

In sintesi, lo studio ha dimostrato l’isolamento dei nanocorpi neutralizzanti la SARS-CoV-2 utilizzando una libreria di visualizzazione del lievito e che la generazione di nanocorpi biparatopici potrebbe apparentemente migliorare la loro efficacia neutralizzante grazie alla reticolazione di diverse proteine ​​​​spike. È interessante notare che la dimerizzazione dei costrutti biparatopici non è riuscita a migliorare la neutralizzazione rispetto alle loro controparti monomeriche.

Riferimento:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310