Mielių ekranas SARS-CoV-2 UBR specifiniams nanokūnams generuoti

Mielių ekranas SARS-CoV-2 UBR specifiniams nanokūnams generuoti

Neseniai paskelbtame tyrime iScience Tyrėjai sukūrė biparatopinius nanokūnus nuo sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

fone

Nepaisant spartaus veiksmingų ir saugių vakcinų nuo SARS-CoV-2 kūrimo, išlieka klausimų dėl jų ilgalaikio veiksmingumo, o tai pateisina nuolatinę naujų gydymo strategijų paiešką. Rekombinantiniai baltymų biologiniai preparatai, tokie kaip monokloniniai antikūnai (mAb), gali būti užkrėstų asmenų profilaktika ir gydymas.

Be to, nanokūnai, antikūnai, turintys vieną kintamą domeną, yra gimtoji kupranugarių šeima. Mažas dydis, didelis stabilumas ir paprasta nanokūnų architektūra yra pranašesni už įprastus mAb. Jie pagerina prasiskverbimą į audinius ir linkę jungtis prie mažų epitopų, turinčių didelį afinitetą. Be to, nanokūnai gali būti kovalentiškai susieti, siekiant pagerinti funkcionalumą ir paprastai turi didesnį derlių bei mažesnes gamybos sąnaudas.

Tyrimas ir rezultatai

Šiame tyrime mokslininkai išskyrė nanokūnus prieš SARS-CoV-2 smaigalio receptorių surišimo domeną (RBD), naudodami sintetinę mielių rodymo biblioteką. UBR buvo paruošti dviem formatais - 1) UBR monomeras su AVI žyma biotinilinti ir 2) dimerinis RBD-Fc, kuriame UBD buvo sulietas su pelės IgG1 fragmentu kristalizuojamu (Fc) domenu.

UBR zondai buvo patvirtinti trumpalaikiu 293T ląstelių transfekavimu žmogaus angiotenziną konvertuojančiu fermentu 2 (hACE2) ir nudažyti tetramerizuotais RBD monomerais. Autoriai nustatė nuo ACE2 priklausomą RBD zondų prisijungimą prie 293T ląstelių, patvirtinančių jų funkcinį vientisumą. Šie tetramerai buvo naudojami UBD specifiniams neutralizuojantiems nanokūnams iš mielių rodymo bibliotekos generuoti.

Atranka apėmė du iš eilės magnetinio sodrinimo etapus, po kurių sekė fluorescencija aktyvuotas ląstelių rūšiavimas (FACS), todėl buvo sukurta biblioteka su maždaug 72% UBR surišančių mielių klonų. Tada biblioteka buvo nudažyta kartu su SARS-CoV-1 ir SARS-CoV-2 UBD tetramerais, todėl gaunamos skirtingos populiacijos.

Viena populiacija (pagrindinė populiacija) jungiasi tik su SARS-CoV-2 UBR tetrameru, o kita (maža) populiacija – su abiejų virusų UBR tetrameru. Tikėtina, kad kryžmiškai reaguojantys SARS-CoV-1/2 klonai gali turėti konservuotą UBR epitopą, kuris yra svarbus taikinys. Tada klonai buvo surūšiuoti pagal atskiras ląsteles ir sekvenuoti dešimt geriausių klonų, turinčių ryškiausią RBD tetramero dažymą.

Žinduolių ekspresijos vektoriai buvo klonuoti su UBR specifinių nanokūnų DNR ir nanokūnai buvo išgryninti. Autoriai išbandė, ar išgryninti nanokūnai slopina ACE2-RBD sąveiką, naudodami surogatinį viruso neutralizacijos tyrimą (sVNT), ir rado keturis nanokūnų klonus (A11, B1, C8 ir G8), kurie slopino prisijungimą. Pažymėtina, kad tik G8 nanokūnas buvo kryžminis reaktyvus su SARS-CoV-1/2.

Nanokūnų klonų UBR surišimo gebėjimas buvo įvertintas naudojant paviršiaus plazmono rezonansą (SPR). Keturi nanokūnai surišo SARS-CoV-2 UBR su vidutiniu afinitetu, o tik G8 surišo SARS-CoV-1 UBR, nors ir su mažesniu afinitetu. Kiti SPR pagrįsti eksperimentai atskleidė du skirtingus surišimo būdus – vienas buvo susijęs su prisijungimu prie bendro epitopo (A11, B1 ir C8 konstrukcijoms), o kitas – prie kito epitopo (G8), kuris buvo labiau konservuotas SARS-CoV-1 UBR.

Nors nanokūnai turėjo vidutinį afinitetą, mažai tikėtina, kad jie stipriai neutralizuos infekciją, palyginti su daugybe naudojamų didelio afiniteto mAb. Todėl mokslininkai sukūrė nanokūnų konstrukcijų seriją, kad padidintų nanokūnų monomerų neutralizavimo galimybes. Buvo naudojami nanokūnų klonai, turintys didžiausią afinitetą (G8 ir B1). Šie tobulinimo eksperimentai apėmė tris skirtingas strategijas.

Pirma, žmogaus IgG1 Fc domenas buvo sujungtas su nanokūnais (B1-Fc ir G8-Fc konstrukcijos). Antra, B1 ir G8 buvo kovalentiškai sujungti per glicino-serino (GS) jungtį (biparatopinės konstrukcijos). Biparatopinės (BP) konstrukcijos buvo sukurtos su trimis skirtingais jungties ilgiais (10, 19 ir 39 aminorūgštimis). Trečia, naudojant žmogaus IgG1 Fc domenus, buvo sukurtos dimerinės biparatopinės konstrukcijos. Buvo atliktas mikroneutralizacijos tyrimas, siekiant patikrinti, ar konstrukcijos slopina SARS-CoV-2 infekciją.

Kaip monomerai, B1 ir G8 vidutiniškai slopina infekciją; Tačiau abiejų nanokūnų Fc dimerizacija pagerino jų neutralizuojantį aktyvumą. Pažymėtina, kad monomerinės biparatopinės konstrukcijos žymiai pagerino neutralizaciją ir padidino jungties ilgį. Biparatopinių konstrukcijų Fc dimerizacija lėmė stiprų neutralizuojantį aktyvumą; Tačiau jie buvo mažiau veiksmingi nei jų monomerų kolegos.

Be to, biparatopiniai nanokūnai buvo išbandyti naudojant daugialypį RBD variantų masyvą, siekiant įvertinti jų gebėjimą įveikti viruso nutekėjimą. Buvo išmatuotas nanokūnų prisijungimas prie susirūpinimą keliančių SARS-CoV-2 variantų (LOJ) UBR ir UBD-ACE2 slopinimas. G8-Fc konstrukcija labai stipriai prisijungė prie visų išbandytų variantų, tačiau B1-Fc nanokūnas sumažino prisijungimą prie beta ir gama variantų RBD, taip pat su E484D, E484K, Q493K ir S494P pakaitalais.

Nepaisant to, biparatopinis nanokūnas su 10 aminorūgščių jungikliu (BP10) turėjo panašų profilį kaip G8-Fc. RBD-ACE2 sąveikos slopinimas buvo išbandytas granulių pagrindu pagamintame sVNT naudojant 20 skirtingų UBR, įskaitant SARS-CoV-1, šikšnosparnių ir pangolino koronavirusų bei Omicron BA.1 ir BA.2 variantus.

Rezultatai buvo panašūs į multipleksinio masyvo rezultatus. Tačiau nanokūnų konstrukcijos negalėjo neutralizuoti Omicron variantų. Galiausiai pelės buvo atskirai apdorotos B1-Fc, G8-Fc ir BP10-Fc konstrukcijomis ir po 24 valandų užkrėstos SARS-CoV-2. Gydymas G8-Fc vidutiniškai sumažino virusų kiekį plaučiuose. Priešingai, pelės, gydomos B1-Fc arba BP10-Fc, buvo visiškai apsaugotos.

Išvados

Apibendrinant, tyrimas parodė SARS-CoV-2 neutralizuojančių nanokūnų išskyrimą naudojant mielių rodymo biblioteką ir kad biparatopinių nanokūnų generavimas gali pagerinti jų neutralizavimo efektyvumą dėl skirtingų smaigalių baltymų kryžminio susiejimo. Įdomu tai, kad biparatopinių konstrukcijų dimerizacija nesugebėjo sustiprinti neutralizacijos, palyginti su jų monomeriniais atitikmenimis.

Nuoroda:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310