Rauga displejs SARS-CoV-2 URB specifisku nanoķermeņu ģenerēšanai

Rauga displejs SARS-CoV-2 URB specifisku nanoķermeņu ģenerēšanai

Nesenā pētījumā, kas publicēts iZinātne Pētnieki ir izstrādājuši biparatopiskas nanoķermeņus pret smagu akūtu respiratorā sindroma koronavīrusu 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

fons

Neskatoties uz efektīvu un drošu vakcīnu pret SARS-CoV-2 straujo attīstību, joprojām pastāv jautājumi par to ilgtermiņa efektivitāti, kas attaisno jaunu terapeitisko stratēģiju meklēšanu. Rekombinantās proteīna bioloģiskās vielas, piemēram, monoklonālās antivielas (mAb), piedāvā potenciālu inficētu personu profilaksei un ārstēšanai.

Turklāt nanoķermeņi, antivielas, kas satur vienu mainīgu domēnu, ir kamieļu dzimtas izcelsmes. Nanoķermeņu mazais izmērs, augstā stabilitāte un vienkāršā arhitektūra ir izdevīgāka salīdzinājumā ar parastajiem mAb. Tie nodrošina uzlabotu iekļūšanu audos un mēdz saistīties ar maziem epitopiem ar augstu afinitāti. Turklāt nanoķermeņus var kovalenti saistīt, lai uzlabotu funkcionalitāti, un tiem parasti ir lielāka raža un zemākas ražošanas izmaksas.

Pētījums un rezultāti

Šajā pētījumā pētnieki izolēja nanoķermeņus pret SARS-CoV-2 smaile receptoru saistošo domēnu (RBD), izmantojot sintētisko rauga displeja bibliotēku. RBD tika sagatavoti divos formātos - 1) RBD monomērs ar AVI tagu biotinilēšanai un 2) dimērisks RBD-Fc, kurā RBD tika sapludināts ar peles IgG1 fragmentu kristalizējamo (Fc) domēnu.

RBD zondes tika apstiprinātas, pārejošu 293T šūnu transfekciju ar cilvēka angiotenzīnu konvertējošo enzīmu 2 (hACE2) un iekrāsotas ar tetramerizētiem RBD monomēriem. Autori atklāja no ACE2 atkarīgu RBD zondu saistīšanos ar 293T šūnām, apstiprinot to funkcionālo integritāti. Šie tetramēri tika izmantoti, lai no rauga displeja bibliotēkas radītu RBD specifiskus neitralizējošus nanoķermeņus.

Atlase ietvēra divus secīgus magnētiskās bagātināšanas posmus, kam sekoja uz fluorescenci aktivizēta šūnu šķirošana (FACS) balstīta bagātināšana, kā rezultātā tika izveidota bibliotēka ar aptuveni 72% RBD saistošiem rauga kloniem. Pēc tam bibliotēka tika iekrāsota ar SARS-CoV-1 un SARS-CoV-2 RBD tetramēriem, iegūstot atšķirīgas populācijas.

Viena populācija (galvenā populācija) saistās tikai ar SARS-CoV-2 URB tetramēru, bet otra (mazākā) populācija saistās ar abu vīrusu UBD tetramēru. Iespējams, ka krusteniski reaģējošajiem SARS-CoV-1/2 kloniem var būt konservēts URB epitops, kas ir svarīgs mērķis. Pēc tam kloni tika sakārtoti pa atsevišķām šūnām un tika sekvencēti desmit labākie kloni ar spilgtāko RBD tetramēra krāsojumu.

Zīdītāju ekspresijas vektori tika klonēti ar RBD specifisko nanoķermeņu DNS, un nanoķermeņi tika attīrīti. Autori pārbaudīja, vai attīrītie nanoķermeņi kavē ACE2-RBD mijiedarbību, izmantojot surogātvīrusu neitralizācijas testu (sVNT), un atklāja četrus nanoķermeņu klonus (A11, B1, C8 un G8), kas kavē saistīšanos. Proti, tikai G8 nanoķermenis bija krusteniski reaģējošs ar SARS-CoV-1/2.

Nanoķermeņu klonu RBD saistīšanās spēja tika novērtēta, izmantojot virsmas plazmonu rezonansi (SPR). Četri nanoķermeņi saistīja SARS-CoV-2 URB ar mērenu afinitāti, bet tikai G8 saistīja SARS-CoV-1 UBD, lai gan ar samazinātu afinitāti. Papildu eksperimenti, kuru pamatā ir SPR, atklāja divus dažādus saistīšanās režīmus - viens saistījās ar kopēju epitopu (A11, B1 un C8 konstrukcijām), bet otrs - ar citu epitopu (G8), kas SARS-CoV-1 UBD ietvaros bija vairāk konservēts.

Lai gan nanoķermeņiem bija mērena afinitāte, maz ticams, ka tie spēcīgi neitralizēs infekciju, salīdzinot ar vairākiem izmantotajiem augstas afinitātes mAb. Tāpēc pētnieki izveidoja virkni nanoķermeņu konstrukciju, lai palielinātu nanoķermeņu monomēru neitralizācijas spēju. Tika izmantoti nanoķermeņu kloni ar visaugstāko afinitāti (G8 un B1). Šie uzlabošanas eksperimenti ietvēra trīs dažādas stratēģijas.

Pirmkārt, cilvēka IgG1 Fc domēns tika sapludināts ar nanoķermeņiem (B1-Fc un G8-Fc konstrukcijas). Otrkārt, B1 un G8 tika kovalenti saistīti, izmantojot glicīna-serīna (GS) saiti (biparatopiskas konstrukcijas). Biparatopiskās (BP) konstrukcijas tika izveidotas ar trīs dažādiem linkeru garumiem (10, 19 un 39 aminoskābēm). Treškārt, izmantojot cilvēka IgG1 Fc domēnus, tika izveidotas dimēriskas biparatopiskās konstrukcijas. Tika veikts mikroneitralizācijas tests, lai pārbaudītu, vai konstrukcijas kavē SARS-CoV-2 infekciju.

Kā monomēri B1 un G8 mēreni inhibēja infekciju; Tomēr abu nanoķermeņu Fc dimerizācija uzlaboja to neitralizējošu aktivitāti. Konkrēti, monomēru biparatopiskās konstrukcijas ievērojami uzlaboja neitralizāciju un palielinājās līdz ar linkera garumu. Biparatopisko konstrukciju Fc dimerizācija izraisīja spēcīgu neitralizējošu aktivitāti; Tomēr tie bija mazāk efektīvi nekā to monomēru kolēģi.

Turklāt biparatopiskās nanoķermeņi tika pārbaudīti, izmantojot multipleksu RBD variantu masīvu, lai novērtētu to spēju pārvarēt vīrusu noplūdi. Tika izmērīta nanoķermeņu saistīšanās ar satraucošo SARS-CoV-2 variantu (GOS) UBR un RBD-ACE2 inhibīcija. G8-Fc konstrukcija ar augstu potenciālu saistījās ar visiem pārbaudītajiem variantiem, bet B1-Fc nanoķermenim bija samazināta saistīšanās ar beta un gamma variantu RBD, kā arī tiem, kas satur E484D, E484K, Q493K un S494P aizvietojumus.

Tomēr biparatopiskajam nanoķermenim ar 10 aminoskābju saiti (BP10) bija līdzīgs profils kā G8-Fc. RBD-ACE2 mijiedarbības kavēšana tika pārbaudīta uz lodītēm balstītā sVNT, izmantojot 20 dažādus UBR, tostarp SARS-CoV-1, sikspārņu un pangolīna koronavīrusu, kā arī Omicron BA.1 un BA.2 variantus.

Rezultāti bija līdzīgi multipleksa masīva rezultātiem. Tomēr nanoķermeņu konstrukcijas nespēja neitralizēt Omicron variantus. Visbeidzot, peles tika atsevišķi apstrādātas ar B1-Fc, G8-Fc un BP10-Fc konstrukcijām un inficētas ar SARS-CoV-2 pēc 24 stundām. Ārstēšana ar G8-Fc mēreni samazināja vīrusu slodzi plaušās. Turpretī peles, kas tika ārstētas ar B1-Fc vai BP10-Fc, bija pilnībā aizsargātas.

Secinājumi

Rezumējot, pētījums parādīja SARS-CoV-2 neitralizējošu nanoķermeņu izolāciju, izmantojot rauga displeja bibliotēku, un ka biparatopisko nanoķermeņu ģenerēšana acīmredzami varētu uzlabot to neitralizēšanas efektivitāti dažādu smaiļu proteīnu šķērssavienojuma dēļ. Interesanti, ka biparatopisko konstrukciju dimerizācija nespēja uzlabot neitralizāciju salīdzinājumā ar to monomēru kolēģiem.

Atsauce:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310