Gistdisplay voor het genereren van SARS-CoV-2 RBD-specifieke nanobodies

Gistdisplay voor het genereren van SARS-CoV-2 RBD-specifieke nanobodies

Uit een recente studie gepubliceerd in iWetenschap Onderzoekers hebben biparatopische nanobodies ontwikkeld tegen het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

achtergrond

Ondanks de snelle ontwikkeling van effectieve en veilige vaccins tegen SARS-CoV-2 blijven er vragen bestaan ​​over de effectiviteit ervan op de lange termijn, wat de voortdurende zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën rechtvaardigt. Recombinante eiwitbiologische geneesmiddelen zoals monoklonale antilichamen (mAbs) bieden potentieel voor de profylaxe en behandeling van geïnfecteerde individuen.

Bovendien zijn nanobodies, antilichamen die één enkel variabel domein bevatten, afkomstig uit de kameelachtigenfamilie. De kleine omvang, hoge stabiliteit en eenvoudige architectuur van nanobodies zijn voordelig ten opzichte van conventionele mAbs. Deze maken verbeterde penetratie in weefsel mogelijk en hebben de neiging zich met hoge affiniteit aan kleine epitopen te binden. Bovendien kunnen nanobodies covalent worden gekoppeld om de functionaliteit te verbeteren en hebben ze doorgaans hogere opbrengsten en lagere productiekosten.

Het onderzoek en de resultaten

In de huidige studie isoleerden onderzoekers nanobodies tegen het receptorbindende domein (RBD) van de SARS-CoV-2-piek met behulp van een synthetische gistdisplaybibliotheek. RBD's werden in twee formaten bereid: 1) RBD-monomeer met een AVI-tag voor biotinylatie en 2) dimere RBD-Fc, waarin de RBD werd gefuseerd aan het fragmentkristalliseerbare (Fc) domein van muis-IgG1.

De RBD-sondes werden gevalideerd door tijdelijke transfectie van 293T-cellen met menselijk angiotensine-converterend enzym 2 (hACE2) en gekleurd met tetrameriseerde RBD-monomeren. De auteurs vonden ACE2-afhankelijke binding van RBD-probes aan 293T-cellen, wat hun functionele integriteit bevestigt. Deze tetrameren werden gebruikt om RBD-specifieke neutraliserende nanobodies te genereren uit een gistdisplaybibliotheek.

De selectie omvatte twee opeenvolgende magnetische verrijkingsstappen, gevolgd door op fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde verrijking, resulterend in een bibliotheek met ongeveer 72% RBD-bindende gistklonen. Vervolgens werd de bibliotheek mede gekleurd met RBD-tetrameren van SARS-CoV-1 en SARS-CoV-2, wat verschillende populaties opleverde.

Eén populatie (hoofdpopulatie) bond uitsluitend het SARS-CoV-2 RBD-tetrameer, terwijl de andere (kleine) populatie het RBD-tetrameer van beide virussen bond. Het is waarschijnlijk dat de kruisreactieve SARS-CoV-1/2-klonen een geconserveerd RBD-epitoop kunnen hebben, dat een belangrijk doelwit vertegenwoordigt. Vervolgens werden de klonen gesorteerd op afzonderlijke cellen en werd de sequentie van de top tien klonen met de helderste RBD-tetrameerkleuring bepaald.

Zoogdierexpressievectoren werden gekloneerd met het DNA van RBD-specifieke nanobodies en de nanobodies werden gezuiverd. De auteurs testten of de gezuiverde nanobodies de ACE2-RBD-interactie remden met behulp van een surrogaatvirusneutralisatietest (sVNT) en vonden vier nanobody-klonen (A11, B1, C8 en G8) die de binding remden. Opvallend is dat alleen het G8-nanobody kruisreactief was met SARS-CoV-1/2.

Het RBD-bindingsvermogen van de nanobody-klonen werd geëvalueerd met behulp van oppervlakteplasmonresonantie (SPR). De vier nanobodies bonden SARS-CoV-2 RBD met matige affiniteit, terwijl alleen G8 de SARS-CoV-1 RBD bond, zij het met verminderde affiniteit. Verdere op SPR gebaseerde experimenten onthulden twee verschillende bindingsmodi: de ene betrof binding aan een gemeenschappelijk epitoop (voor A11-, B1- en C8-constructen) en de andere aan een ander epitoop (G8) dat meer geconserveerd was binnen het SARS-CoV-1 RBD.

Hoewel de nanobodies gematigde affiniteiten hadden, was het onwaarschijnlijk dat ze de infectie sterk zouden neutraliseren vergeleken met de meerdere gebruikte mAbs met hoge affiniteit. Daarom creëerden de onderzoekers een reeks nanobody-constructen om het neutralisatievermogen van nanobody-monomeren te vergroten. De nanobody-klonen met de hoogste affiniteiten (G8 en B1) werden gebruikt. Deze verbeteringsexperimenten omvatten drie verschillende strategieën.

Eerst werd een menselijk IgG1 Fc-domein gefuseerd met de nanobodies (B1-Fc- en G8-Fc-constructen). Ten tweede werden B1 en G8 covalent gekoppeld via een glycine-serine (GS) linker (biparatopische constructen). De biparatopische (BP) constructen werden gegenereerd met drie verschillende linkerlengtes (10, 19 en 39 aminozuren). Ten derde werden dimere biparatopische constructen gegenereerd met behulp van menselijke IgG1 Fc-domeinen. Er werd een microneutralisatietest uitgevoerd om te testen of de constructen de SARS-CoV-2-infectie remden.

Als monomeren remden B1 en G8 de infectie matig; Fc-dimerisatie van beide nanobodies verbeterde echter hun neutraliserende activiteit. Met name versterkten de monomere biparatopische constructen de neutralisatie aanzienlijk en namen toe met de lengte van de linker. Fc-dimerisatie van biparatopische constructen resulteerde in krachtige neutraliserende activiteit; Ze waren echter minder effectief dan hun monomeer-tegenhangers.

Bovendien werden de biparatopische nanobodies getest met behulp van een multiplex RBD-variantarray om hun vermogen om viruslekkage te overwinnen te evalueren. De binding van nanobodies aan RBD’s van zorgwekkende SARS-CoV-2-varianten (VOC’s) en RBD-ACE2-remming werden gemeten. Het G8-Fc-construct bond met hoge potentie aan alle geteste varianten, maar het B1-Fc-nanobody vertoonde een verminderde binding aan bèta- en gammavariant-RBD's, evenals aan die met E484D-, E484K-, Q493K- en S494P-substituties.

Niettemin had het biparatopische nanolichaam met een linker van 10 aminozuren (BP10) een vergelijkbaar profiel als G8-Fc. De remming van de RBD-ACE2-interactie werd getest in een op kralen gebaseerde sVNT met behulp van 20 verschillende RBD's, waaronder die van SARS-CoV-1, vleermuis- en schubdiercoronavirussen, en de Omicron BA.1- en BA.2-varianten.

De resultaten waren vergelijkbaar met die van de multiplexarray. De nanobody-constructen waren echter niet in staat de Omicron-varianten te neutraliseren. Tenslotte werden de muizen afzonderlijk behandeld met B1-Fc-, G8-Fc- en BP10-Fc-constructen en na 24 uur geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Behandeling met G8-Fc verminderde de virale last in de longen matig. Daarentegen waren muizen behandeld met B1-Fc of BP10-Fc volledig beschermd.

Conclusies

Samenvattend demonstreerde de studie de isolatie van SARS-CoV-2-neutraliserende nanobodies met behulp van een gistdisplaybibliotheek en dat de generatie van biparatopische nanobodies blijkbaar hun neutraliserende effectiviteit zou kunnen verbeteren als gevolg van de verknoping van verschillende piekeiwitten. Interessant is dat dimerisatie van de biparatopische constructen er niet in slaagde de neutralisatie te versterken in vergelijking met hun monomere tegenhangers.

Referentie:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310