Gjærdisplay for generering av SARS-CoV-2 RBD-spesifikke nanokropper

Gjærdisplay for generering av SARS-CoV-2 RBD-spesifikke nanokropper

I en fersk studie publisert i iScience Forskere har utviklet biparatopiske nanokropper mot alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

bakgrunn

Til tross for den raske utviklingen av effektive og trygge vaksiner mot SARS-CoV-2, gjenstår spørsmål angående deres langsiktige effektivitet, noe som rettferdiggjør det fortsatte søket etter nye terapeutiske strategier. Biologiske rekombinante proteiner som monoklonale antistoffer (mAbs) tilbyr potensial for profylakse og behandling av infiserte individer.

I tillegg er nanostoffer, antistoffer som inneholder et enkelt variabelt domene, hjemmehørende i kamelfamilien. Den lille størrelsen, høye stabiliteten og den enkle arkitekturen til nanokropper er fordelaktig fremfor konvensjonelle mAbs. Disse muliggjør forbedret penetrasjon i vev og har en tendens til å binde seg til små epitoper med høy affinitet. I tillegg kan nanokropper kobles kovalent for å forbedre funksjonaliteten og har vanligvis høyere utbytte og lavere produksjonskostnader.

Studien og resultatene

I denne studien isolerte forskere nanokropper mot reseptorbindingsdomenet (RBD) til SARS-CoV-2-piggen ved å bruke et syntetisk gjærvisningsbibliotek. RBD-er ble fremstilt i to formater - 1) RBD-monomer med en AVI-merke for biotinylering og 2) dimer RBD-Fc, hvor RBD ble fusjonert til det fragmentkrystalliserbare (Fc)-domenet til muse-IgG1.

RBD-probene ble validert ved forbigående transfeksjon av 293T-celler med humant angiotensin-konverterende enzym 2 (hACE2) og farget med tetrameriserte RBD-monomerer. Forfatterne fant ACE2-avhengig binding av RBD-prober til 293T-celler, noe som bekrefter deres funksjonelle integritet. Disse tetramerene ble brukt til å generere RBD-spesifikke nøytraliserende nanobodies fra et gjærvisningsbibliotek.

Utvelgelsen involverte to påfølgende magnetiske berikelsestrinn, etterfulgt av fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-basert berikelse, noe som resulterte i et bibliotek med omtrent 72% RBD-bindende gjærkloner. Deretter ble biblioteket farget sammen med RBD-tetramerer av SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, noe som ga distinkte populasjoner.

En populasjon (hovedpopulasjon) bandt utelukkende SARS-CoV-2 RBD-tetramer, mens den andre (mindre) populasjonen bandt RBD-tetramer av begge virusene. Det er sannsynlig at de kryssreaktive SARS-CoV-1/2-klonene kan ha en konservert RBD-epitop, som representerer et viktig mål. Deretter ble klonene sortert etter enkeltceller og de ti beste klonene med den lyseste RBD-tetramerfargingen ble sekvensert.

Pattedyrekspresjonsvektorer ble klonet med DNA fra RBD-spesifikke nanobodies og nanobodies ble renset. Forfatterne testet om de rensede nanostoffene hemmet ACE2-RBD-interaksjon ved å bruke en surrogatvirusnøytraliseringsanalyse (sVNT) og fant fire nanobody-kloner (A11, B1, C8 og G8) som hemmet binding. Spesielt var det bare G8 nanobody som var kryssreaktive med SARS-CoV-1/2.

RBD-bindingskapasiteten til nanobody-klonene ble evaluert ved bruk av overflateplasmonresonans (SPR). De fire nanostoffene bandt SARS-CoV-2 RBD med moderat affinitet, mens bare G8 bandt SARS-CoV-1 RBD, om enn med redusert affinitet. Ytterligere SPR-baserte eksperimenter avslørte to forskjellige bindingsmodi - den ene involverte binding til en felles epitop (for A11, B1 og C8-konstruksjoner) og den andre til en annen epitop (G8) som var mer konservert i SARS-CoV-1 RBD.

Selv om nanobodies hadde moderate affiniteter, var det usannsynlig at de sterkt nøytraliserte infeksjon sammenlignet med de multiple høyaffinitets mAbs som ble brukt. Derfor skapte forskerne en serie nanobody-konstruksjoner for å øke nøytraliseringskapasiteten til nanobody-monomerer. Nanobody-klonene med de høyeste affinitetene (G8 og B1) ble brukt. Disse forbedringseksperimentene inkluderte tre forskjellige strategier.

Først ble et humant IgG1 Fc-domene smeltet sammen til nanobodies (B1-Fc- og G8-Fc-konstruksjoner). For det andre ble B1 og G8 kovalent koblet via en glycin-serin (GS) linker (biparatopiske konstruksjoner). De biparatopiske (BP) konstruksjonene ble generert med tre forskjellige linkerlengder (10, 19 og 39 aminosyrer). For det tredje ble dimere biparatopiske konstruksjoner generert ved bruk av humane IgG1 Fc-domener. En mikronøytraliseringsanalyse ble utført for å teste om konstruksjonene hemmet SARS-CoV-2-infeksjon.

Som monomerer hemmet B1 og G8 moderat infeksjon; Imidlertid forbedret Fc-dimerisering av begge nanokroppene deres nøytraliserende aktivitet. Spesielt forbedret de monomere biparatopiske konstruksjonene betydelig nøytralisering og økte med linkerlengde. Fc-dimerisering av biparatopiske konstruksjoner resulterte i kraftig nøytraliserende aktivitet; Imidlertid var de mindre effektive enn monomer-motstykkene.

Videre ble de biparatopiske nanostoffene testet ved å bruke en multipleks RBD-variantarray for å evaluere deres evne til å overvinne viruslekkasje. Binding av nanokropper til RBD-er av SARS-CoV-2-varianter av bekymring (VOC) og RBD-ACE2-hemming ble målt. G8-Fc-konstruksjonen bandt med høy styrke til alle varianter som ble testet, men B1-Fc-nanokroppen viste redusert binding til beta- og gammavariant-RBD-er, så vel som de som inneholder E484D-, E484K-, Q493K- og S494P-substitusjoner.

Ikke desto mindre hadde den biparatopiske nanokroppen med en 10-aminosyrelinker (BP10) en lignende profil som G8-Fc. Hemming av RBD-ACE2-interaksjonen ble testet i en perlebasert sVNT ved bruk av 20 forskjellige RBD-er, inkludert de fra SARS-CoV-1, flaggermus- og pangolin-koronavirus, og Omicron BA.1 og BA.2-variantene.

Resultatene var lik resultatene for multipleksarrayen. Imidlertid klarte ikke nanobody-konstruksjonene å nøytralisere Omicron-variantene. Til slutt ble musene behandlet separat med B1-Fc-, G8-Fc- og BP10-Fc-konstruksjoner og infisert med SARS-CoV-2 etter 24 timer. Behandling med G8-Fc moderat redusert virusmengde i lungene. Derimot ble mus behandlet med B1-Fc eller BP10-Fc fullstendig beskyttet.

Konklusjoner

Oppsummert demonstrerte studien isoleringen av SARS-CoV-2-nøytraliserende nanokropper ved bruk av et gjærvisningsbibliotek og at genereringen av biparatopiske nanokropper tilsynelatende kunne forbedre deres nøytraliserende effektivitet på grunn av tverrbindingen av forskjellige piggproteiner. Interessant nok klarte ikke dimerisering av de biparatopiske konstruksjonene å forbedre nøytralisering sammenlignet med deres monomere motstykker.

Referanse:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310