Wyświetlacz drożdżowy do generowania nanociał specyficznych dla SARS-CoV-2 RBD

Wyświetlacz drożdżowy do generowania nanociał specyficznych dla SARS-CoV-2 RBD

W niedawnym badaniu opublikowanym w iNauka Naukowcy opracowali dwuparatopowe nanociała przeciwko koronawirusowi 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

tło

Pomimo szybkiego rozwoju skutecznych i bezpiecznych szczepionek przeciwko SARS-CoV-2, pozostają pytania dotyczące ich długoterminowej skuteczności, uzasadniającej ciągłe poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych. Biologiczne rekombinowane białka, takie jak przeciwciała monoklonalne (mAb), oferują potencjał w profilaktyce i leczeniu zakażonych osób.

Ponadto nanociał, przeciwciała zawierające pojedynczą domenę zmienną, pochodzi z rodziny wielbłądowatych. Mały rozmiar, wysoka stabilność i prosta architektura nanociał są zaletą w porównaniu z konwencjonalnymi mAb. Umożliwiają one lepszą penetrację do tkanki i mają tendencję do wiązania się z małymi epitopami z dużym powinowactwem. Ponadto nanociał można łączyć kowalencyjnie w celu poprawy funkcjonalności, co zazwyczaj zapewnia wyższą wydajność i niższe koszty produkcji.

Badanie i wyniki

W niniejszym badaniu badacze wyizolowali nanociał przeciwko domenie wiążącej receptor (RBD) szczytu SARS-CoV-2, korzystając z syntetycznej biblioteki prezentacyjnej na drożdżach. RBD przygotowano w dwóch formatach - 1) monomer RBD ze znacznikiem AVI do biotynylacji i 2) dimeryczny RBD-Fc, w którym RBD połączono z domeną ulegającą krystalizacji (Fc) mysiej IgG1.

Sondy RBD zweryfikowano poprzez przejściową transfekcję komórek 293T ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2) i wybarwienie tetrameryzowanymi monomerami RBD. Autorzy odkryli zależne od ACE2 wiązanie sond RBD z komórkami 293T, potwierdzając ich integralność funkcjonalną. Tetramery wykorzystano do wygenerowania nanociał neutralizujących specyficznych dla RBD z biblioteki prezentacyjnej na drożdżach.

Selekcja obejmowała dwa kolejne etapy wzbogacania magnetycznego, po których następowało wzbogacanie w oparciu o sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), w wyniku czego powstała biblioteka zawierająca około 72% klonów drożdży wiążących RBD. Następnie bibliotekę wybarwiono tetramerami RBD SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2, uzyskując odrębne populacje.

Jedna populacja (główna populacja) wiązała wyłącznie tetramer RBD SARS-CoV-2, podczas gdy druga (mniejsza) populacja wiązała tetramer RBD obu wirusów. Jest prawdopodobne, że reagujące krzyżowo klony SARS-CoV-1/2 mogą mieć konserwatywny epitop RBD, który stanowi ważny cel. Następnie klony posortowano według pojedynczych komórek i zsekwencjonowano dziesięć najlepszych klonów z najjaśniejszym barwieniem tetrameru RBD.

Ssacze wektory ekspresyjne sklonowano z DNA nanociał specyficznych dla RBD, a nanociał oczyszczono. Autorzy sprawdzili, czy oczyszczone nanociał hamują interakcję ACE2-RBD za pomocą zastępczego testu neutralizacji wirusa (sVNT) i znaleźli cztery klony nanociał (A11, B1, C8 i G8), które hamowały wiązanie. Warto zauważyć, że tylko nanociało G8 wykazywało reakcję krzyżową z SARS-CoV-1/2.

Zdolność wiązania RBD klonów nanociał oceniano za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Cztery nanociał wiązały RBD SARS-CoV-2 z umiarkowanym powinowactwem, podczas gdy tylko G8 wiązał RBD SARS-CoV-1, aczkolwiek ze zmniejszonym powinowactwem. Dalsze eksperymenty oparte na SPR ujawniły dwa różne tryby wiązania – jeden obejmował wiązanie ze wspólnym epitopem (dla konstruktów A11, B1 i C8), a drugi z innym epitopem (G8), który był bardziej konserwatywny w RBD SARS-CoV-1.

Chociaż nanociał wykazywały umiarkowane powinowactwo, było mało prawdopodobne, aby silnie neutralizowały infekcję w porównaniu z wieloma zastosowanymi mAb o wysokim powinowactwie. Dlatego badacze stworzyli serię konstruktów nanociał, aby zwiększyć zdolność neutralizacji monomerów nanociał. Zastosowano klony nanociał o najwyższym powinowactwie (G8 i B1). Te eksperymenty udoskonalające obejmowały trzy różne strategie.

Najpierw połączono domenę Fc ludzkiej IgG1 z nanociałami (konstrukty B1-Fc i G8-Fc). Po drugie, B1 i G8 połączono kowalencyjnie poprzez łącznik glicyno-serynowy (GS) (konstrukty biparatopowe). Wytworzono konstrukty biparatopowe (BP) z trzema różnymi długościami łączników (10, 19 i 39 aminokwasów). Po trzecie, wygenerowano dimeryczne konstrukty biparatopowe przy użyciu ludzkich domen Fc IgG1. Przeprowadzono test mikroneutralizacji, aby sprawdzić, czy konstrukty hamują infekcję SARS-CoV-2.

Jako monomery B1 i G8 umiarkowanie hamowały infekcję; Jednakże dimeryzacja Fc obu nanociał poprawiła ich aktywność neutralizującą. Warto zauważyć, że monomeryczne konstrukty biparatopowe znacząco wzmocniły neutralizację i zwiększyły się wraz z długością łącznika. Dimeryzacja Fc konstruktów biparatopowych spowodowała silną aktywność neutralizującą; Były one jednak mniej skuteczne niż ich monomerowe odpowiedniki.

Co więcej, dwuparatopowe nanociał przetestowano przy użyciu multipleksowej macierzy wariantów RBD, aby ocenić ich zdolność do przezwyciężenia wycieku wirusa. Zmierzono wiązanie nanociał z RBD budzących obawy wariantów SARS-CoV-2 (LZO) i hamowanie RBD-ACE2. Konstrukt G8-Fc wiązał się z dużą siłą ze wszystkimi testowanymi wariantami, ale nanociało B1-Fc wykazywało zmniejszone wiązanie z wariantami RBD beta i gamma, a także tymi zawierającymi podstawienia E484D, E484K, Q493K i S494P.

Niemniej jednak dwuparatopowe nanociało z 10-aminokwasowym łącznikiem (BP10) miało podobny profil do G8-Fc. Hamowanie interakcji RBD-ACE2 testowano w sVNT na bazie kulek przy użyciu 20 różnych RBD, w tym pochodzących z SARS-CoV-1, koronawirusów nietoperzy i łuskowców oraz wariantów Omicron BA.1 i BA.2.

Wyniki były podobne do wyników uzyskanych w przypadku układu multipleksowego. Jednakże konstrukty nanociała nie były w stanie zneutralizować wariantów Omicron. Na koniec myszy traktowano oddzielnie konstruktami B1-Fc, G8-Fc i BP10-Fc i zakażono SARS-CoV-2 po 24 godzinach. Leczenie G8-Fc umiarkowanie obniżyło miano wirusa w płucach. W przeciwieństwie do tego, myszy leczone B1-Fc lub BP10-Fc były całkowicie chronione.

Wnioski

Podsumowując, badanie wykazało izolację nanociał neutralizujących SARS-CoV-2 przy użyciu biblioteki prezentacyjnej na drożdżach oraz że wytwarzanie nanociał dwuparatopowych mogłoby najwyraźniej poprawić ich skuteczność neutralizującą ze względu na sieciowanie różnych białek kolczastych. Co ciekawe, dimeryzacja konstruktów biparatopowych nie zwiększyła neutralizacji w porównaniu z ich monomerycznymi odpowiednikami.

Odniesienie:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310