Exibição de levedura para geração de nanocorpos específicos para SARS-CoV-2 RBD

Exibição de levedura para geração de nanocorpos específicos para SARS-CoV-2 RBD

Num estudo recente publicado em iCiência Pesquisadores desenvolveram nanocorpos biparatópicos contra o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

fundo

Apesar do rápido desenvolvimento de vacinas eficazes e seguras contra o SARS-CoV-2, permanecem questões quanto à sua eficácia a longo prazo, justificando a procura contínua de novas estratégias terapêuticas. Produtos biológicos proteicos recombinantes, como anticorpos monoclonais (mAbs), oferecem potencial para a profilaxia e tratamento de indivíduos infectados.

Além disso, os nanocorpos, anticorpos que contêm um único domínio variável, são nativos da família dos camelídeos. O tamanho pequeno, a alta estabilidade e a arquitetura simples dos nanocorpos são vantajosos em relação aos mAbs convencionais. Estes permitem uma melhor penetração no tecido e tendem a ligar-se a pequenos epítopos com elevada afinidade. Além disso, os nanocorpos podem ser ligados covalentemente para melhorar a funcionalidade e normalmente apresentam rendimentos mais elevados e custos de produção mais baixos.

O estudo e resultados

No presente estudo, os pesquisadores isolaram nanocorpos contra o domínio de ligação ao receptor (RBD) do pico SARS-CoV-2 usando uma biblioteca de exibição de levedura sintética. Os RBDs foram preparados em dois formatos - 1) monômero RBD com um marcador AVI para biotinilação e 2) RBD-Fc dimérico, no qual o RBD foi fundido ao domínio cristalizável do fragmento (Fc) da IgG1 de camundongo.

As sondas RBD foram validadas por transfecção transitória de células 293T com enzima conversora de angiotensina humana 2 (hACE2) e coradas com monômeros RBD tetramerizados. Os autores encontraram ligação dependente de ACE2 de sondas RBD a células 293T, confirmando sua integridade funcional. Esses tetrâmeros foram usados ​​para gerar nanocorpos neutralizantes específicos de RBD a partir de uma biblioteca de exibição de levedura.

A seleção envolveu duas etapas consecutivas de enriquecimento magnético, seguidas de enriquecimento baseado em classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), resultando em uma biblioteca com aproximadamente 72% de clones de levedura de ligação a RBD. Em seguida, a biblioteca foi co-corada com tetrâmeros RBD de SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, produzindo populações distintas.

Uma população (população principal) ligou-se exclusivamente ao tetrâmero RBD do SARS-CoV-2, enquanto a outra população (menor) ligou-se ao tetrâmero RBD de ambos os vírus. É provável que os clones de reação cruzada SARS-CoV-1/2 possam ter um epítopo RBD conservado, que representa um alvo importante. Em seguida, os clones foram classificados por células únicas e os dez melhores clones com a coloração mais brilhante do tetrâmero RBD foram sequenciados.

Os vetores de expressão de mamíferos foram clonados com o DNA de nanocorpos específicos de RBD e os nanocorpos foram purificados. Os autores testaram se os nanocorpos purificados inibiam a interação ACE2-RBD usando um ensaio substituto de neutralização de vírus (sVNT) e encontraram quatro clones de nanocorpos (A11, B1, C8 e G8) que inibiram a ligação. Notavelmente, apenas o nanocorpo do G8 apresentou reação cruzada com SARS-CoV-1/2.

A capacidade de ligação de RBD dos clones de nanocorpos foi avaliada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os quatro nanocorpos ligaram o RBD do SARS-CoV-2 com afinidade moderada, enquanto apenas o G8 ligou o RBD do SARS-CoV-1, embora com afinidade reduzida. Outras experiências baseadas em SPR revelaram dois modos de ligação diferentes - um envolveu a ligação a um epítopo comum (para construções A11, B1 e C8) e o outro a um epítopo diferente (G8) que foi mais conservado dentro do RBD do SARS-CoV-1.

Embora os nanocorpos tivessem afinidades moderadas, era improvável que neutralizassem fortemente a infecção em comparação com os múltiplos mAbs de alta afinidade utilizados. Portanto, os pesquisadores criaram uma série de construções de nanocorpos para aumentar a capacidade de neutralização dos monômeros de nanocorpos. Foram utilizados os clones de nanocorpos com maiores afinidades (G8 e B1). Esses experimentos de melhoria incluíram três estratégias diferentes.

Primeiro, um domínio Fc de IgG1 humano foi fundido aos nanocorpos (construções B1-Fc e G8-Fc). Em segundo lugar, B1 e G8 foram ligados covalentemente através de um ligante glicina-serina (GS) (construções biparatópicas). As construções biparatópicas (BP) foram geradas com três comprimentos de ligante diferentes (10, 19 e 39 aminoácidos). Terceiro, foram geradas construções biparatópicas diméricas utilizando domínios Fc de IgG1 humana. Um ensaio de microneutralização foi realizado para testar se as construções inibiam a infecção por SARS-CoV-2.

Como monômeros, B1 e G8 inibiram moderadamente a infecção; No entanto, a dimerização Fc de ambos os nanocorpos melhorou a sua atividade neutralizante. Notavelmente, as construções biparatópicas monoméricas melhoraram significativamente a neutralização e aumentaram com o comprimento do ligante. A dimerização Fc de construções biparatópicas resultou em potente atividade neutralizante; No entanto, eles foram menos eficazes do que os seus homólogos monómeros.

Além disso, os nanocorpos biparatópicos foram testados usando uma matriz variante RBD multiplex para avaliar sua capacidade de superar o vazamento de vírus. A ligação de nanocorpos a RBDs de variantes preocupantes do SARS-CoV-2 (VOCs) e a inibição de RBD-ACE2 foram medidas. A construção G8-Fc ligou-se com alta potência a todas as variantes testadas, mas o nanocorpo B1-Fc mostrou ligação reduzida a RBDs variantes beta e gama, bem como aqueles contendo substituições E484D, E484K, Q493K e S494P.

No entanto, o nanocorpo biparatópico com ligante de 10 aminoácidos (BP10) apresentou perfil semelhante ao G8-Fc. A inibição da interação RBD-ACE2 foi testada em um sVNT baseado em esferas usando 20 RBDs diferentes, incluindo aqueles de SARS-CoV-1, coronavírus de morcego e pangolim, e as variantes Omicron BA.1 e BA.2.

Os resultados foram semelhantes aos do array multiplex. No entanto, as construções de nanocorpos não foram capazes de neutralizar as variantes Omicron. Finalmente, os ratos foram tratados separadamente com construções B1-Fc, G8-Fc e BP10-Fc e infectados com SARS-CoV-2 após 24 horas. O tratamento com G8-Fc reduziu moderadamente a carga viral nos pulmões. Em contraste, os ratos tratados com B1-Fc ou BP10-Fc ficaram completamente protegidos.

Conclusões

Em resumo, o estudo demonstrou o isolamento de nanocorpos neutralizantes de SARS-CoV-2 usando uma biblioteca de exibição de levedura e que a geração de nanocorpos biparatópicos poderia aparentemente melhorar sua eficácia neutralizante devido à ligação cruzada de diferentes proteínas de pico. Curiosamente, a dimerização das construções biparatópicas não conseguiu aumentar a neutralização em comparação com as suas contrapartes monoméricas.

Referência:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310