Display de drojdie pentru generarea de nanocorpi specifici SARS-CoV-2 RBD

Display de drojdie pentru generarea de nanocorpi specifici SARS-CoV-2 RBD

Într-un studiu recent publicat în iScience Cercetătorii au dezvoltat nanocorpi biparatopici împotriva coronavirusului 2 (SARS-CoV-2) a sindromului respirator acut sever.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

fundal

În ciuda dezvoltării rapide a vaccinurilor eficiente și sigure împotriva SARS-CoV-2, rămân întrebări cu privire la eficacitatea acestora pe termen lung, justificând căutarea continuă a unor noi strategii terapeutice. Proteinele biologice recombinante, cum ar fi anticorpii monoclonali (mAb) oferă potențial pentru profilaxia și tratamentul persoanelor infectate.

În plus, nanocorpii, anticorpii care conțin un singur domeniu variabil, sunt nativi din familia camelidelor. Dimensiunea mică, stabilitatea ridicată și arhitectura simplă a nanocorpilor sunt avantajoase față de mAb-urile convenționale. Acestea permit o penetrare îmbunătățită în țesut și tind să se lege de epitopi mici cu afinitate ridicată. În plus, nanocorpii pot fi legați covalent pentru a îmbunătăți funcționalitatea și au, de obicei, randamente mai mari și costuri de producție mai mici.

Studiul și rezultatele

În studiul de față, cercetătorii au izolat nanocorpii împotriva domeniului de legare la receptor (RBD) al vârfului SARS-CoV-2 folosind o bibliotecă de afișare a drojdiei sintetice. RBD-urile au fost preparate în două formate - 1) monomer RBD cu o etichetă AVI pentru biotinilare și 2) RBD-Fc dimeric, în care RBD a fost fuzionat cu domeniul cristalizabil al fragmentului (Fc) al IgG1 de șoarece.

Sondele RBD au fost validate prin transfecția tranzitorie a celulelor 293T cu enzima 2 de conversie a angiotensinei umane (hACE2) și colorate cu monomeri RBD tetramerizati. Autorii au descoperit legarea dependentă de ACE2 a sondelor RBD de celulele 293T, confirmând integritatea lor funcțională. Acești tetrameri au fost utilizați pentru a genera nanocorpi de neutralizare specifici RBD dintr-o bibliotecă de afișare a drojdiei.

Selecția a implicat două etape consecutive de îmbogățire magnetică, urmate de îmbogățirea bazată pe sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS), rezultând o bibliotecă cu aproximativ 72% clone de drojdie care leagă RBD. Apoi, biblioteca a fost colorată împreună cu tetramerii RBD ai SARS-CoV-1 și SARS-CoV-2, producând populații distincte.

O populație (populația principală) s-a legat exclusiv de tetramerul RBD SARS-CoV-2, în timp ce cealaltă populație (minoră) a legat tetramerul RBD al ambelor viruși. Este probabil ca clonele SARS-CoV-1/2 reactive încrucișate să aibă un epitop RBD conservat, care reprezintă o țintă importantă. Apoi, clonele au fost sortate pe celule individuale și au fost secvențiate primele zece clone cu cea mai strălucitoare colorare cu tetramer RBD.

Vectorii de expresie de mamifere au fost donați cu ADN-ul nanocorpilor specifici RBD și nanocorpii au fost purificați. Autorii au testat dacă nanocorpii purificați au inhibat interacțiunea ACE2-RBD folosind un test de neutralizare a virusului surogat (sVNT) și au găsit patru clone de nanocorpi (A11, B1, C8 și G8) care au inhibat legarea. În special, doar nanocorpul G8 a fost reactiv încrucișat cu SARS-CoV-1/2.

Capacitatea de legare a RBD a clonelor de nanocorp a fost evaluată folosind rezonanța plasmonului de suprafață (SPR). Cele patru nanocorpi au legat SARS-CoV-2 RBD cu afinitate moderată, în timp ce doar G8 a legat SARS-CoV-1 RBD, deși cu afinitate redusă. Alte experimente bazate pe SPR au dezvăluit două moduri de legare diferite - unul a implicat legarea la un epitop comun (pentru constructele A11, B1 și C8) și celălalt la un epitop diferit (G8) care a fost mai conservat în RBD SARS-CoV-1.

Deși nanocorpii aveau afinități moderate, este puțin probabil ca aceștia să neutralizeze puternic infecția în comparație cu multiplele mAb cu afinitate ridicată utilizate. Prin urmare, cercetătorii au creat o serie de construcții de nanocorpi pentru a crește capacitatea de neutralizare a monomerilor de nanocorpi. Au fost utilizate clonele nanocorpilor cu cele mai mari afinități (G8 și B1). Aceste experimente de îmbunătățire au inclus trei strategii diferite.

În primul rând, un domeniu Fc IgG1 uman a fost fuzionat la nanocorpi (construcții B1-Fc și G8-Fc). În al doilea rând, B1 și G8 au fost legate covalent printr-un linker glicină-serină (GS) (construcții biparatopice). Construcțiile biparatopice (BP) au fost generate cu trei lungimi diferite de linker (10, 19 și 39 de aminoacizi). În al treilea rând, au fost generate construcții biparatopice dimerice utilizând domeniile Fc IgG1 umane. A fost efectuat un test de microneutralizare pentru a testa dacă constructele au inhibat infecția cu SARS-CoV-2.

Ca monomeri, B1 și G8 au inhibat moderat infecția; Cu toate acestea, dimerizarea Fc a ambelor nanocorpi a îmbunătățit activitatea lor de neutralizare. În special, construcțiile biparatopice monomerice au îmbunătățit semnificativ neutralizarea și au crescut cu lungimea linkerului. Dimerizarea Fc a constructelor biparatopice a dus la o activitate de neutralizare puternică; Cu toate acestea, au fost mai puțin eficiente decât omologii lor monomeri.

În plus, nanocorpii biparatopici au fost testați folosind o matrice de variante RBD multiplex pentru a evalua capacitatea lor de a depăși scurgerea virusului. Au fost măsurate legarea nanocorpilor de RBD ale variantelor de îngrijorare SARS-CoV-2 (VOC) și inhibarea RBD-ACE2. Construcția G8-Fc s-a legat cu potență ridicată la toate variantele testate, dar nanocorpul B1-Fc a arătat o legare redusă la RBD-uri variante beta și gamma, precum și la cele care conțin substituții E484D, E484K, Q493K și S494P.

Cu toate acestea, nanocorpul biparatopic cu un linker de 10 aminoacizi (BP10) a avut un profil similar cu G8-Fc. Inhibarea interacțiunii RBD-ACE2 a fost testată într-un sVNT pe bază de mărgele folosind 20 de RBD diferite, inclusiv cele de la SARS-CoV-1, coronavirusurile de lilieci și pangolin și variantele Omicron BA.1 și BA.2.

Rezultatele au fost similare cu cele ale matricei multiplex. Cu toate acestea, constructele nanocorpului nu au putut neutraliza variantele Omicron. În cele din urmă, șoarecii au fost tratați separat cu constructe B1-Fc, G8-Fc și BP10-Fc și infectați cu SARS-CoV-2 după 24 de ore. Tratamentul cu G8-Fc a redus moderat încărcătura virală în plămâni. În contrast, șoarecii tratați cu B1-Fc sau BP10-Fc au fost complet protejați.

Concluzii

În rezumat, studiul a demonstrat izolarea nanocorpilor de neutralizare a SARS-CoV-2 folosind o bibliotecă de afișare a drojdiei și că generarea de nanocorpi biparatopici ar putea aparent îmbunătăți eficacitatea neutralizantă a acestora datorită legăturii diferitelor proteine ​​​​spike. Interesant, dimerizarea constructelor biparatopice nu a reușit să îmbunătățească neutralizarea în comparație cu omologii lor monomerici.

Referinţă:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310