Displej kvasiniek na generovanie nanobody špecifických pre SARS-CoV-2 RBD

Displej kvasiniek na generovanie nanobody špecifických pre SARS-CoV-2 RBD

V nedávnej štúdii publikovanej v iScience Vedci vyvinuli biparatopické nanoprotilátky proti koronavírusu 2 s ťažkým akútnym respiračným syndrómom (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

pozadia

Napriek rýchlemu vývoju účinných a bezpečných vakcín proti SARS-CoV-2 zostávajú otázky týkajúce sa ich dlhodobej účinnosti, čo odôvodňuje pokračujúce hľadanie nových terapeutických stratégií. Rekombinantné proteínové biologické látky, ako sú monoklonálne protilátky (mAb), ponúkajú potenciál na profylaxiu a liečbu infikovaných jedincov.

Okrem toho nanoprotilátky, protilátky obsahujúce jednu variabilnú doménu, sú natívne v čeľade ťavovitých. Malá veľkosť, vysoká stabilita a jednoduchá architektúra nanobody sú výhodné oproti bežným mAb. Tieto umožňujú zlepšenú penetráciu do tkaniva a majú tendenciu viazať sa na malé epitopy s vysokou afinitou. Okrem toho nanobody môžu byť kovalentne spojené, aby sa zlepšila funkčnosť a zvyčajne majú vyššie výťažky a nižšie výrobné náklady.

Štúdia a výsledky

V tejto štúdii výskumníci izolovali nanobody proti receptorovej väzbovej doméne (RBD) špičky SARS-CoV-2 pomocou syntetickej kvasinkovej zobrazovacej knižnice. RBD boli pripravené v dvoch formátoch - 1) monomér RBD s AVI tagom pre biotinyláciu a 2) dimérny RBD-Fc, v ktorom bol RBD fúzovaný s fragmentom kryštalizovateľnej (Fc) domény myšieho IgG1.

Sondy RBD boli validované prechodnou transfekciou buniek 293T ľudským enzýmom konvertujúcim angiotenzín 2 (hACE2) a zafarbené tetramerizovanými monomérmi RBD. Autori našli väzbu sond RBD na bunky 293T závislú od ACE2, čo potvrdilo ich funkčnú integritu. Tieto tetraméry sa použili na vytvorenie RBD-špecifických neutralizačných nanoprotilátok z knižnice kvasinkového displeja.

Selekcia zahŕňala dva po sebe idúce kroky magnetického obohatenia, po ktorých nasledovalo obohatenie na báze fluorescenčne aktivovaného triedenia buniek (FACS), výsledkom čoho bola knižnica s približne 72 % kvasinkových klonov viažucich RBD. Ďalej sa knižnica spoločne zafarbila s RBD tetramérmi SARS-CoV-1 a SARS-CoV-2, čím sa získali odlišné populácie.

Jedna populácia (hlavná populácia) viazala výlučne SARS-CoV-2 RBD tetramér, zatiaľ čo druhá (vedľajšia) populácia viazala RBD tetramér oboch vírusov. Je pravdepodobné, že skrížene reaktívne klony SARS-CoV-1/2 môžu mať konzervovaný epitop RBD, ktorý predstavuje dôležitý cieľ. Ďalej sa klony triedili podľa jednotlivých buniek a sekvenovalo sa prvých desať klonov s najjasnejším zafarbením tetraméru RBD.

Cicavčie expresné vektory boli klonované s DNA RBD-špecifických nanoprotilátok a nanobody boli purifikované. Autori testovali, či purifikované nanobody inhibovali interakciu ACE2-RBD pomocou testu neutralizačného náhradného vírusu (sVNT) a našli štyri klony nanoprotilátok (A11, B1, C8 a G8), ktoré inhibovali väzbu. Je pozoruhodné, že iba nanobody G8 boli skrížene reaktívne so SARS-CoV-1/2.

Väzbová kapacita RBD klonov nanoprotilátok sa hodnotila pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR). Štyri nanobody viazali SARS-CoV-2 RBD so strednou afinitou, zatiaľ čo iba G8 viazal SARS-CoV-1 RBD, aj keď so zníženou afinitou. Ďalšie experimenty založené na SPR odhalili dva rôzne väzbové režimy - jeden zahŕňal väzbu na spoločný epitop (pre konštrukty A11, B1 a C8) a druhý na iný epitop (G8), ktorý bol v SARS-CoV-1 RBD viac konzervovaný.

Hoci nanoprotilátky mali mierne afinity, bolo nepravdepodobné, že by silne neutralizovali infekciu v porovnaní s viacerými použitými vysokoafinitnými mAb. Preto výskumníci vytvorili sériu konštruktov nanobody na zvýšenie neutralizačnej kapacity monomérov nanobody. Boli použité klony nanobody s najvyššími afinitami (G8 a B1). Tieto zlepšovacie experimenty zahŕňali tri rôzne stratégie.

Najprv bola humánna IgG1 Fc doména fúzovaná k nanoprotilátkam (B1-Fc a G8-Fc konštrukty). Po druhé, B1 a G8 boli kovalentne spojené cez glycín-serínový (GS) linker (biparatopické konštrukty). Biparatopické (BP) konštrukty boli vytvorené s tromi rôznymi dĺžkami linkera (10, 19 a 39 aminokyselín). Po tretie, boli vytvorené dimérne biparatopické konštrukty s použitím ľudských IgG1 Fc domén. Uskutočnil sa mikroneutralizačný test, aby sa otestovalo, či konštrukty inhibujú infekciu SARS-CoV-2.

Ako monoméry B1 a G8 mierne inhibovali infekciu; Fc dimerizácia oboch nanoprotilátok však zlepšila ich neutralizačnú aktivitu. Najmä monomérne biparatopické konštrukty výrazne zosilnili neutralizáciu a zvýšili sa s dĺžkou linkera. Fc dimerizácia biparatopických konštruktov viedla k silnej neutralizačnej aktivite; Boli však menej účinné ako ich monomérne náprotivky.

Okrem toho boli biparatopické nanobody testované pomocou multiplexného poľa variantov RBD, aby sa vyhodnotila ich schopnosť prekonať únik vírusu. Merala sa väzba nanoprotilátok na RBD obávaných variantov SARS-CoV-2 (VOC) a inhibícia RBD-ACE2. Konštrukt G8-Fc sa viazal s vysokou účinnosťou na všetky testované varianty, ale nanoprotilátka B1-Fc vykazovala zníženú väzbu na beta a gama variant RBD, ako aj na tie, ktoré obsahujú substitúcie E484D, E484K, Q493K a S494P.

Napriek tomu biparatopická nanoprotilátka s 10-aminokyselinovým linkerom (BP10) mala podobný profil ako G8-Fc. Inhibícia interakcie RBD-ACE2 bola testovaná v sVNT na báze guľôčok s použitím 20 rôznych RBD vrátane tých z SARS-CoV-1, koronavírusov netopierov a pangolínov a variantov Omicron BA.1 a BA.2.

Výsledky boli podobné ako pri multiplexnom poli. Konštrukty nanobody však neboli schopné neutralizovať varianty Omicron. Nakoniec boli myši oddelene ošetrené konštruktmi B1-Fc, G8-Fc a BP10-Fc a infikované SARS-CoV-2 po 24 hodinách. Liečba G8-Fc mierne znížila vírusovú záťaž v pľúcach. Na rozdiel od toho myši liečené B1-Fc alebo BP10-Fc boli úplne chránené.

Závery

Stručne povedané, štúdia preukázala izoláciu nanoprotilátok neutralizujúcich SARS-CoV-2 pomocou knižnice kvasinkového displeja a že generovanie biparatopických nanoprotilátok by zjavne mohlo zlepšiť ich neutralizačnú účinnosť v dôsledku zosieťovania rôznych hrotových proteínov. Je zaujímavé, že dimerizácia biparatopických konštruktov nedokázala zvýšiť neutralizáciu v porovnaní s ich monomérnymi náprotivkami.

Referencia:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310