Prikaz kvasovk za generiranje nanoteles, specifičnih za SARS-CoV-2 RBD

Prikaz kvasovk za generiranje nanoteles, specifičnih za SARS-CoV-2 RBD

V nedavni študiji, objavljeni v iScience Raziskovalci so razvili biparatopična nanotelesa proti hudemu akutnemu respiratornemu sindromu koronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

ozadje

Kljub hitremu razvoju učinkovitih in varnih cepiv proti SARS-CoV-2 ostajajo vprašanja glede njihove dolgoročne učinkovitosti, kar upravičuje nadaljnje iskanje novih terapevtskih strategij. Rekombinantna beljakovinska biološka zdravila, kot so monoklonska protitelesa (mAbs), ponujajo potencial za profilakso in zdravljenje okuženih posameznikov.

Poleg tega so nanotelesa, protitelesa, ki vsebujejo eno samo variabilno domeno, domača v družini kamel. Majhna velikost, visoka stabilnost in preprosta arhitektura nanoteles so v prednosti pred običajnimi mAbs. Ti omogočajo izboljšano penetracijo v tkivo in se vežejo na majhne epitope z visoko afiniteto. Poleg tega je mogoče nanotelesa kovalentno povezati, da izboljšajo funkcionalnost in imajo običajno višje donose in nižje proizvodne stroške.

Študija in rezultati

V tej študiji so raziskovalci izolirali nanotelesa proti receptorski vezni domeni (RBD) konice SARS-CoV-2 z uporabo knjižnice za prikazovanje sintetičnih kvasovk. RBD so bili pripravljeni v dveh formatih - 1) monomer RBD z oznako AVI za biotinilacijo in 2) dimerni RBD-Fc, v katerem je bil RBD spojen z domeno, ki jo je mogoče kristalizirati (Fc) fragmenta mišjega IgG1.

Sonde RBD so bile validirane s prehodno transfekcijo celic 293T s človeškim encimom za pretvorbo angiotenzina 2 (hACE2) in obarvane s tetrameriziranimi monomeri RBD. Avtorji so odkrili od ACE2 odvisno vezavo sond RBD na celice 293T, kar potrjuje njihovo funkcionalno celovitost. Ti tetrameri so bili uporabljeni za ustvarjanje nevtralizirajočih nanoteles, specifičnih za RBD, iz knjižnice prikaza kvasovk.

Izbor je vključeval dva zaporedna koraka magnetne obogatitve, ki ji je sledila obogatitev na osnovi fluorescenčno aktiviranega razvrščanja celic (FACS), kar je povzročilo knjižnico s približno 72 % klonov kvasovk, ki vežejo RBD. Nato je bila knjižnica soobarvana s tetramerji RBD SARS-CoV-1 in SARS-CoV-2, kar je prineslo različne populacije.

Ena populacija (glavna populacija) je vezala izključno tetramer RBD SARS-CoV-2, medtem ko je druga (manjša) populacija vezala tetramer RBD obeh virusov. Verjetno imajo lahko navzkrižno reaktivni kloni SARS-CoV-1/2 ohranjen epitop RBD, ki predstavlja pomembno tarčo. Nato so bili kloni razvrščeni po posameznih celicah in sekvenciranih je bilo prvih deset klonov z najsvetlejšim RBD tetramernim obarvanjem.

Sesalske ekspresijske vektorje smo klonirali z DNA RBD-specifičnih nanoteles in nanotelesa očistili. Avtorji so testirali, ali očiščena nanotelesa zavirajo interakcijo ACE2-RBD z uporabo testa nevtralizacije nadomestnega virusa (sVNT) in našli štiri klone nanoteles (A11, B1, C8 in G8), ki so zavirali vezavo. Predvsem je bilo samo nanotelo G8 navzkrižno reaktivno s SARS-CoV-1/2.

Sposobnost vezave RBD klonov nanoteles je bila ovrednotena z uporabo površinske plazmonske resonance (SPR). Štiri nanotelesa so vezala SARS-CoV-2 RBD z zmerno afiniteto, medtem ko je samo G8 vezalo SARS-CoV-1 RBD, čeprav z zmanjšano afiniteto. Nadaljnji poskusi na podlagi SPR so razkrili dva različna načina vezave – eden je vključeval vezavo na skupni epitop (za konstrukte A11, B1 in C8), drugi pa na drug epitop (G8), ki je bil bolj ohranjen znotraj SARS-CoV-1 RBD.

Čeprav so imela nanotelesa zmerne afinitete, je bilo malo verjetno, da bi močno nevtralizirala okužbo v primerjavi z večkratnimi uporabljenimi mAbs z visoko afiniteto. Zato so raziskovalci ustvarili vrsto konstruktov nanoteles, da bi povečali nevtralizacijsko zmogljivost monomerov nanoteles. Uporabljeni so bili kloni nanoteles z najvišjo afiniteto (G8 in B1). Ti poskusi izboljšav so vključevali tri različne strategije.

Najprej je bila človeška domena IgG1 Fc spojena z nanotelesci (konstrukti B1-Fc in G8-Fc). Drugič, B1 in G8 sta bila kovalentno povezana preko povezovalca glicin-serin (GS) (biparatopični konstrukti). Biparatopični (BP) konstrukti so bili ustvarjeni s tremi različnimi dolžinami povezovalnikov (10, 19 in 39 aminokislin). Tretjič, dimerni biparatopični konstrukti so bili ustvarjeni z uporabo človeških IgG1 Fc domen. Izveden je bil test mikronevtralizacije, da bi preverili, ali konstrukti zavirajo okužbo s SARS-CoV-2.

Kot monomera sta B1 in G8 zmerno zavirala okužbo; Vendar je Fc dimerizacija obeh nanoteles izboljšala njuno nevtralizacijsko aktivnost. Predvsem so monomerni biparatopni konstrukti znatno izboljšali nevtralizacijo in se povečali z dolžino povezovalca. Fc dimerizacija biparatopičnih konstruktov je povzročila močno nevtralizacijsko aktivnost; Vendar so bili manj učinkoviti kot njihovi monomerni kolegi.

Poleg tega so bila biparatopična nanotelesa testirana z uporabo variantnega niza multipleksa RBD, da bi ocenili njihovo sposobnost premagovanja uhajanja virusa. Izmerili so vezavo nanoteles na RBD zaskrbljujočih različic SARS-CoV-2 (VOC) in inhibicijo RBD-ACE2. Konstrukt G8-Fc se je z visoko močjo vezal na vse testirane različice, vendar je nanotelo B1-Fc pokazalo zmanjšano vezavo na RBD različice beta in gama ter na tiste, ki vsebujejo substitucije E484D, E484K, Q493K in S494P.

Kljub temu je imelo biparatopično nanotelo z 10-aminokislinskim povezovalnikom (BP10) podoben profil kot G8-Fc. Zaviranje interakcije RBD-ACE2 je bilo preizkušeno v sVNT na osnovi kroglic z uporabo 20 različnih RBD, vključno s tistimi iz SARS-CoV-1, koronavirusov netopirjev in pangolina ter različic Omicron BA.1 in BA.2.

Rezultati so bili podobni tistim pri multipleksnem nizu. Vendar konstrukti nanoteles niso mogli nevtralizirati različic omikrona. Na koncu so miši ločeno zdravili s konstrukti B1-Fc, G8-Fc in BP10-Fc in jih po 24 urah okužili s SARS-CoV-2. Zdravljenje z G8-Fc je zmerno zmanjšalo virusno obremenitev v pljučih. Nasprotno pa so bile miši, zdravljene z B1-Fc ali BP10-Fc, popolnoma zaščitene.

Sklepi

Če povzamemo, je študija pokazala izolacijo nevtralizirajočih nanoteles SARS-CoV-2 z uporabo knjižnice za prikazovanje kvasovk in da bi generiranje biparatopičnih nanoteles očitno lahko izboljšalo njihovo nevtralizacijsko učinkovitost zaradi navzkrižnega povezovanja različnih koničastih proteinov. Zanimivo je, da dimerizacija biparatopičnih konstruktov ni uspela povečati nevtralizacije v primerjavi z njihovimi monomernimi dvojniki.

Referenca:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310