Jästdisplay för generering av SARS-CoV-2 RBD-specifika nanokroppar

Jästdisplay för generering av SARS-CoV-2 RBD-specifika nanokroppar

I en nyligen publicerad studie publicerad i iScience Forskare har utvecklat biparatopiska nanokroppar mot allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

bakgrund

Trots den snabba utvecklingen av effektiva och säkra vacciner mot SARS-CoV-2 kvarstår frågor om deras långsiktiga effektivitet, vilket motiverar det fortsatta sökandet efter nya terapeutiska strategier. Rekombinanta proteinbiologiska läkemedel såsom monoklonala antikroppar (mAbs) erbjuder potential för profylax och behandling av infekterade individer.

Dessutom är nanokroppar, antikroppar som innehåller en enda variabel domän, inhemska i kamelidfamiljen. Den lilla storleken, höga stabiliteten och enkla arkitekturen hos nanokroppar är fördelaktiga jämfört med konventionella mAbs. Dessa möjliggör förbättrad penetration i vävnad och tenderar att binda till små epitoper med hög affinitet. Dessutom kan nanokroppar kopplas kovalent för att förbättra funktionaliteten och har vanligtvis högre avkastning och lägre produktionskostnader.

Studien och resultaten

I den aktuella studien isolerade forskare nanokroppar mot den receptorbindande domänen (RBD) av SARS-CoV-2-spiken med hjälp av ett syntetiskt jästvisningsbibliotek. RBD framställdes i två format - 1) RBD-monomer med en AVI-tagg för biotinylering och 2) dimer RBD-Fc, i vilken RBD fusionerades till den fragmentkristalliserbara (Fc) domänen av mus IgG1.

RBD-proberna validerades genom transient transfektion av 293T-celler med humant angiotensinomvandlande enzym 2 (hACE2) och färgades med tetrameriserade RBD-monomerer. Författarna fann ACE2-beroende bindning av RBD-sonder till 293T-celler, vilket bekräftar deras funktionella integritet. Dessa tetramerer användes för att generera RBD-specifika neutraliserande nanokroppar från ett jästvisningsbibliotek.

Urvalet involverade två på varandra följande magnetiska anrikningssteg, följt av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad anrikning, vilket resulterade i ett bibliotek med cirka 72% RBD-bindande jästkloner. Därefter samfärgades biblioteket med RBD-tetramerer av SARS-CoV-1 och SARS-CoV-2, vilket gav distinkta populationer.

En population (huvudpopulation) band uteslutande SARS-CoV-2 RBD-tetramer, medan den andra (mindre) populationen band RBD-tetramer av båda virusen. Det är troligt att de korsreaktiva SARS-CoV-1/2-klonerna kan ha en konserverad RBD-epitop, som representerar ett viktigt mål. Därefter sorterades klonerna efter enstaka celler och de tio bästa klonerna med den ljusaste RBD-tetramerfärgningen sekvenserades.

Däggdjursexpressionsvektorer klonades med DNA från RBD-specifika nanokroppar och nanokropparna renades. Författarna testade om de renade nanokropparna hämmade ACE2-RBD-interaktion med hjälp av en surrogatvirusneutraliseringsanalys (sVNT) och fann fyra nanokroppkloner (A11, B1, C8 och G8) som hämmade bindning. Noterbart var att endast G8 nanobody var korsreaktiv med SARS-CoV-1/2.

RBD-bindningskapaciteten hos nanokroppsklonerna utvärderades med användning av ytplasmonresonans (SPR). De fyra nanokropparna band SARS-CoV-2 RBD med måttlig affinitet, medan endast G8 band SARS-CoV-1 RBD, om än med reducerad affinitet. Ytterligare SPR-baserade experiment avslöjade två olika bindningssätt - en involverade bindning till en gemensam epitop (för A11, B1 och C8 konstruktioner) och den andra till en annan epitop (G8) som var mer konserverad inom SARS-CoV-1 RBD.

Även om nanokropparna hade måttlig affinitet, var det osannolikt att de kraftigt neutraliserade infektion jämfört med de multipla högaffinitetsmAbs som användes. Därför skapade forskarna en serie nanokroppskonstruktioner för att öka neutraliseringskapaciteten hos nanokroppmonomerer. Nanobody-klonerna med de högsta affiniteterna (G8 och B1) användes. Dessa förbättringsexperiment inkluderade tre olika strategier.

Först fusionerades en human IgG1 Fc-domän till nanokropparna (B1-Fc- och G8-Fc-konstruktioner). För det andra var B1 och G8 kovalent kopplade via en glycin-serin (GS) linker (biparatopiska konstruktioner). De biparatopiska (BP)-konstruktionerna genererades med tre olika länklängder (10, 19 och 39 aminosyror). För det tredje genererades dimera biparatopiska konstruktioner med användning av humana IgGl Fc-domäner. En mikroneutraliseringsanalys utfördes för att testa om konstruktionerna hämmade SARS-CoV-2-infektion.

Som monomerer hämmade B1 och G8 måttligt infektion; Fc-dimerisering av båda nanokropparna förbättrade emellertid deras neutraliserande aktivitet. Noterbart förbättrade de monomera biparatopiska konstruktionerna signifikant neutraliseringen och ökade med länklängden. Fc-dimerisering av biparatopiska konstruktioner resulterade i potent neutraliserande aktivitet; De var dock mindre effektiva än sina monomermotsvarigheter.

Dessutom testades de biparatopiska nanokropparna med en multiplex RBD-variantuppsättning för att utvärdera deras förmåga att övervinna virusläckage. Bindning av nanokroppar till RBD av SARS-CoV-2-varianter av oro (VOC) och RBD-ACE2-hämning mättes. G8-Fc-konstruktionen band med hög styrka till alla testade varianter, men B1-Fc-nanokroppen visade minskad bindning till beta- och gammavarianter RBD såväl som de som innehöll E484D, E484K, Q493K och S494P substitutioner.

Ändå hade den biparatopiska nanokroppen med en länk på 10 aminosyror (BP10) en liknande profil som G8-Fc. Hämning av RBD-ACE2-interaktionen testades i en pärlbaserad sVNT med användning av 20 olika RBD, inklusive de från SARS-CoV-1, fladdermus- och pangolin-coronavirus, och Omicron BA.1 och BA.2-varianterna.

Resultaten liknade de för multiplexarrayen. Men nanokroppskonstruktionerna kunde inte neutralisera Omicron-varianterna. Slutligen behandlades mössen separat med B1-Fc-, G8-Fc- och BP10-Fc-konstruktioner och infekterades med SARS-CoV-2 efter 24 timmar. Behandling med G8-Fc måttligt reducerad virusmängd i lungorna. Däremot var möss behandlade med B1-Fc eller BP10-Fc fullständigt skyddade.

Slutsatser

Sammanfattningsvis visade studien isoleringen av SARS-CoV-2-neutraliserande nanokroppar med hjälp av ett jästvisningsbibliotek och att genereringen av biparatopiska nanokroppar uppenbarligen kunde förbättra deras neutraliserande effektivitet på grund av tvärbindningen av olika spikproteiner. Intressant nog misslyckades dimerisering av de biparatopiska konstruktionerna att öka neutraliseringen jämfört med deras monomera motsvarigheter.

Hänvisning:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310