用于生成 SARS-CoV-2 RBD 特异性纳米抗体的酵母展示

用于生成 SARS-CoV-2 RBD 特异性纳米抗体的酵母展示

在最近发表的一项研究中 科学 研究人员开发出了针对严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的双互补位纳米抗体。

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

背景

尽管针对 SARS-CoV-2 的有效且安全的疫苗快速开发，但其长期有效性仍存在疑问，因此需要继续寻找新的治疗策略。 单克隆抗体 (mAb) 等重组蛋白生物制剂为预防和治疗感染个体提供了潜力。

此外，纳米抗体（含有单个可变结构域的抗体）是骆驼科的天然产物。 纳米抗体尺寸小、稳定性高、结构简单，比传统单克隆抗体具有优势。 这些能够改善对组织的渗透，并倾向于以高亲和力与小表位结合。 此外，纳米抗体可以共价连接以改善功能，并且通常具有更高的产量和更低的生产成本。

研究及结果

在本研究中，研究人员使用合成酵母展示文库分离了针对 SARS-CoV-2 刺突受体结合域 (RBD) 的纳米抗体。 RBD 以两种形式制备 - 1) 带有用于生物素化的 AVI 标签的 RBD 单体和 2) 二聚 RBD-Fc，其中 RBD 与小鼠 IgG1 的片段可结晶 (Fc) 结构域融合。

RBD 探针通过用人血管紧张素转换酶 2 (hACE2) 瞬时转染 293T 细胞进行验证，并用四聚 RBD 单体染色。 作者发现 RBD 探针与 293T 细胞的 ACE2 依赖性结合，证实了它们的功能完整性。 这些四聚体用于从酵母展示文库中生成 RBD 特异性中和纳米抗体。

选择涉及两个连续的磁性富集步骤，然后是基于荧光激活细胞分选 (FACS) 的富集，从而产生含有大约 72% RBD 结合酵母克隆的文库。 接下来，该文库与 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 的 RBD 四聚体共染色，产生不同的群体。

一个群体（主要群体）仅结合 SARS-CoV-2 RBD 四聚体，而另一群体（次要群体）则结合两种病毒的 RBD 四聚体。 交叉反应的 SARS-CoV-1/2 克隆可能具有保守的 RBD 表位，它代表了一个重要的靶点。 接下来，将克隆按单细胞分选，并对RBD四聚体染色最亮的前十个克隆进行测序。

用 RBD 特异性纳米抗体的 DNA 克隆哺乳动物表达载体，并纯化纳米抗体。 作者使用替代病毒中和测定 (sVNT) 测试了纯化的纳米抗体是否抑制 ACE2-RBD 相互作用，并发现了四个抑制结合的纳米抗体克隆（A11、B1、C8 和 G8）。 值得注意的是，只有 G8 纳米抗体与 SARS-CoV-1/2 发生交叉反应。

使用表面等离子共振（SPR）评估纳米抗体克隆的RBD结合能力。 四种纳米抗体以中等亲和力结合 SARS-CoV-2 RBD，而只有 G8 结合 SARS-CoV-1 RBD，尽管亲和力降低。 进一步的基于 SPR 的实验揭示了两种不同的结合模式——一种涉及与共同表位（针对 A11、B1 和 C8 构建体）的结合，另一种涉及与 SARS-CoV-1 RBD 中更保守的不同表位 (G8) 的结合。

尽管纳米抗体具有中等亲和力，但与使用的多种高亲和力单克隆抗体相比，它们不太可能强烈中和感染。 因此，研究人员创建了一系列纳米抗体构建体，以提高纳米抗体单体的中和能力。 使用具有最高亲和力的纳米抗体克隆（G8和B1）。 这些改进实验包括三种不同的策略。

首先，将人 IgG1 Fc 结构域融合至纳米抗体（B1-Fc 和 G8-Fc 构建体）。 其次，B1 和 G8 通过甘氨酸-丝氨酸 (GS) 连接体共价连接（双互补位构建体）。 双互补位 (BP) 构建体采用三种不同的接头长度（10、19 和 39 个氨基酸）生成。 第三，使用人 IgG1 Fc 结构域生成二聚体双互补位构建体。 进行了微中和测定，以测试该构建体是否抑制 SARS-CoV-2 感染。

作为单体，B1和G8具有中等程度的抑制感染作用； 然而，两种纳米体的 Fc 二聚化提高了它们的中和活性。 值得注意的是，单体双互补位构建体显着增强了中和作用，并随着接头长度的增加而增加。 双互补位构建体的 Fc 二聚化导致有效的中和活性； 然而，它们的效果不如单体对应物。

此外，使用多重 RBD 变体阵列测试了双互补位纳米抗体，以评估其克服病毒渗漏的能力。 测量了纳米抗体与 SARS-CoV-2 相关变体 (VOC) 的 RBD 的结合以及 RBD-ACE2 抑制。 G8-Fc 构建体与所有测试的变体均具有高效结合，但 B1-Fc 纳米抗体显示出与 β 和 γ 变体 RBD 以及含有 E484D、E484K、Q493K 和 S494P 取代的 RBD 的结合减少。

然而，具有 10 个氨基酸接头 (BP10) 的双互补位纳米抗体具有与 G8-Fc 相似的特征。 使用 20 种不同的 RBD 在基于珠子的 sVNT 中测试了 RBD-ACE2 相互作用的抑制，包括来自 SARS-CoV-1、蝙蝠和穿山甲冠状病毒以及 Omicron BA.1 和 BA.2 变体的 RBD。

结果与多重阵列的结果相似。 然而，纳米抗体构建体无法中和 Omicron 变体。 最后，分别用 B1-Fc、G8-Fc 和 BP10-Fc 构建体治疗小鼠，并在 24 小时后感染 SARS-CoV-2。 G8-Fc 治疗可适度降低肺部病毒载量。 相比之下，用 B1-Fc 或 BP10-Fc 治疗的小鼠受到完全保护。

结论

总之，该研究证明使用酵母展示文库分离 SARS-CoV-2 中和纳米抗体，并且由于不同刺突蛋白的交联，双互补位纳米抗体的生成可以明显提高其中和效果。 有趣的是，与单体对应物相比，双互补位构建体的二聚化未能增强中和作用。

参考：

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310