Ny metode bruger nanopore-pincet til at lette hæmning af SARS-CoV-2-helikasen ved enkelt nukleotidopløsning

Ny metode bruger nanopore-pincet til at lette hæmning af SARS-CoV-2-helikasen ved enkelt nukleotidopløsning

I en nylig undersøgelse offentliggjort i bioRxiv * Preprint-server: Forskere visualiserede virkningsmekanismen og hæmningen af ​​ikke-strukturelt protein 13 (NSP13) af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) med høj spatiotemporal opløsning.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Vigtig BEMÆRK:bioRxiv udgiver foreløbige videnskabelige rapporter, der ikke er peer-reviewed og derfor ikke bør betragtes som afgørende, beregnet til at vejlede klinisk praksis/sundhedsrelateret adfærd eller behandles som etableret information.

baggrund

Af alle 15 SARS-COV-2 NSP'er er NSP13, en ribonukleinsyre (RNA) helicase, afgørende for dens replikation. Der er dog i øjeblikket ingen godkendte antivirale lægemidler, der er målrettet mod NSP13. I modsætning til SARS-CoV-2 strukturelle proteiner er aminosyresekvensen af ​​nsp13 en af ​​de mest konserverede blandt mange typer af coronavirus (CoV) (f. inklusive Omicron. Tilsammen gør dette nsp13 til et attraktivt bredspektret antiviralt mål med potentiale til at bekæmpe fremtidige CoV-udbrud.

Strukturelle og biokemiske undersøgelser har vist, at nsp13 er en superfamilie 1B (SF1B) RNA-helicase. Den anvender en inchworm-mekanisme til translokation langs enkeltstrengede (ss) nukleinsyresubstrater (NA), hvorigennem nsp13 sandsynligvis afvikler NA-duplekser. På grund af dens lille trinstørrelse var enkeltmolekyleteknikker ikke i stand til at dechifrere den hastighed, hvormed nsp13 bevæger sig langs sit NA-substrat. En sådan opløsning kunne give indsigt i, hvordan hæmmende molekyler påvirker deres virkemåde.

Om studiet

I denne undersøgelse udviklede forskere enkelt-molekyle picometer resolution nanopore pincet (SPRNT) til at måle trinene i SARS-CoV-2 nsp13 bevægelse på DNA-strenge. Derudover viste de, hvordan SPRNT kan bruges til at bestemme virkningsmekanismen for en helicasehæmmer. Holdet designede en enkelt nanopore af Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) i et fosfolipid-dobbeltlag. En spænding påført denne membran fik en strøm af ioner til at strømme gennem nanoporen og trække negativt ladet NA gennem poren.

Forskellige NA-baser i nanoporen forårsagede unikke ioniske strømblokke, der kunne afkodes til NA-sekvensen. En helicase bundet til den fangede NA-streng kommer til at hvile ved porekanten og trækker NA, hvilket fører til successive ionstrømstrin. Holdet løste disse i enkeltnukleotidtrin på submillisekunders tidsskalaer for at observere bevægelsen af ​​helicasen langs NA. Samtidig bestemte de NA-sekvensen af ​​substratet i helicasen.

Det er også bemærkelsesværdigt, at SPRNT udøvede en kraft, der var proportional med den påførte spænding på enzym/NA-komplekset, som understøttede eller modstod bevægelsen af ​​nsp13, afhængigt af hvilken ende af nanopore NA var bundet til. Derudover observerede holdet bevægelsen af ​​NSP13 langs NA'er i nærvær af adenosintriphosphatase (ATPase)-hæmmeren ATPγS.

Studieresultater

Forskerne registrerede 2.413 individuelle NSP13-translokations- og afviklingshændelser og 27.641 helicase-trin. Studieresultaterne bekræftede, at NSP13 translokerede langs ssDNA og afviklede DNA-duplekser med en hastighed på ca. 100 basepar pr. sekund. NSP13-translokationshastigheden var ATP-afhængig, med den maksimale reaktionshastighed (Vmax) mellem 600 og 3000 s−1 og Michaelis-konstanten (Km) mellem 100 og 700 µM for ATP, afhængigt af den underliggende sekvenskontekst i NSP13. Så store forskelle i translokationshastigheder ved forskellige DNA-positioner antydede, at NA-baseidentitet påvirkede NSP13-translokationskinetikken.

Undersøgelsesresultaterne viste også, at NSP13-DNA-komplekset var mindre stabilt og var lettere at bryde fra hinanden med kraft. Variation af støttekraften fra ~24 PicoNewtons (pN) til ~44 pN ved mættet ATP forårsagede ikke en signifikant ændring i den gennemsnitlige translokationshastighed af NSP13. Ydermere antydede dette, at NSP13-translokation overvejende var en ATP-hydrolyse-drevet bevægelse.

Forfatterne fandt også, at trinene til at afvikle dsDNA-dupleksen (i gennemsnit) var næsten otte gange længere end trinene for ssDNA-translokation. Desuden var afvikling af dsDNA langsommere end translokation af ssDNA, selvom deres opholdstider var korreleret. En lignende effekt blev observeret i en anden undersøgelse, der undersøgte SF1A helicase PcrA ved hjælp af SPRNT. Interessant nok danner den RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRp) af SARS-CoV-2 og NSP13 et kompleks ved ca. 170 nt/s ved 37°C, svarende til hvad der blev observeret som NSP13-afviklingshastighed med SPRNT.

Desuden fandt forfatterne, at ATPγS svækkede virkningen af ​​NSP13 via flere forskellige kinetiske processer. Den fremherskende mekanisme afhang imidlertid af anvendelsen af ​​støttekraft. Selvom ATPγS ikke er en levedygtig lægemiddelkandidat for NSP13, demonstrerede det kraften af ​​SPRNT til at studere mekanismerne for helicasehæmning. Tre metoder til NSP13-hæmning er blevet identificeret:

i) at reducere dens processivitet,

ii) at forhindre sammenføjningen af ​​dets domæner 1A og 2A efter nukleotidbinding og

iii) Nedsættelse af ATPγS hydrolyse sammenlignet med ATP.

Konklusioner

Samlet set fremhævede undersøgelsen SPRNT som et værdifuldt og kraftfuldt værktøj til at undersøge NSP13's rolle inden for replikations- og transkriptionskomplekset (RTC) af SARS-CoV-2. SPRNT-metoden demonstrerede også en overlegen evne til at lette studiet af kinetikken af ​​NSP13-translokation eller enhver helicase, selv i fravær af en duplex. Ydermere kunne SPRNT-eksperimenter lette studiet af NSP13 på native SARS-CoV-2-sekvenser for at kaste lys over specifikke sekvenselementer i det højt strukturerede SARS-CoV-2-genom og deres rolle i NSP13-regulering.

*Vigtig BEMÆRK:bioRxiv udgiver foreløbige videnskabelige rapporter, der ikke er peer-reviewed og derfor ikke bør betragtes som afgørende, beregnet til at vejlede klinisk praksis/sundhedsrelateret adfærd eller behandles som etableret information.

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1