Плурипотентни стволови клетки от прилепи като модел за изучаване на нови вируси

Плурипотентни стволови клетки от прилепи като модел за изучаване на нови вируси

Прилепите са еволюирали с уникални характеристики като ларингеална ехолокация и полет, като някои са способни да понасят вируси като коронавирусите на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoVs), близкоизточните респираторни синдроми CoVs (MERS-CoVs) и вирусите Marburg и Nipah. Разработването на стабилни клетъчно базирани модели на прилепи може да доведе до по-добро разбиране на управлението на вирусите на прилепите и тяхната биология.

В наскоро публикувано проучване по темата bioRxiv * Сървър за предпечат: Изследователите са генерирали индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPSCs) от прилепи Rhinolophus ferrumequinum, използвайки модифицирания протокол Yamanaka, за да установят прилепите като нов in vivo вид за моделно изследване.

проучване: Плурипотентните стволови клетки на прилеп разкриват уникална взаимовръзка гостоприемник-вирус.Снимка кредит: Jezper / Shutterstock.com

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

Относно изследването

В настоящото проучване изследователите проучват дали прилепите могат да бъдат подходящи за производство на вируси.

Подходът за препрограмиране на Yamanaka беше използван въз основа на фактори за препрограмиране като Y-box-2 гена за определящ пола регион, октамер-свързващ транскрипционен фактор 4 (Oct4), cMyc и Kruppel-подобен фактор 4 (Klf4).

Клетки от ембрионални фибробласти на прилеп (BEF) бяха изолирани от R. ferrumequinum с нива на препрограмиращи фактори, променени за активиране и блокиране на множество сигнални пътища. Освен това бяха извършени и имунооцветяване и анализи за секвениране на рибонуклеинова киселина (РНК) (RNA-seq).

Получаване на плурипотентни стволови клетки от прилепи. (A) Илюстрация на стратегията за получаване на плурипотентни стволови клетки от прилепи. BEF, ембрионални фибробласти; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, фибробластна среда; PSC, плурипотентна среда за стволови клетки; PSC+, PSC с добавки. (B) Морфология на установени BiPS клетъчни колонии, отгледани върху миши ембрионални фибробласти. (C) Имунофлуоресцентно откриване на Oct4 в BiPS клетки. (D) MA диаграма на RNA-seq данни, илюстриращи транскрипционните разлики между ембрионални фибробласти на прилепи (BEF) и плурипотентни стволови клетки (BiPS). Подбрани гени с известни функции за установяване или поддържане на плурипотентност са подчертани. (E) K среден клъстерен анализ на ATAC-seq сигнали, получени от BEF или BiPS клетки. C, клъстери. (F), Диаграма на плътността на резултатите от RRBS, получени от BEF и BiPS клетки. PCC, корелационен коефициент на Пиърсън. (G) Графики на разсейване на състоянието на метилиране на хистон 3 при K4 (активираща хроматинова модификация) или K27 (репресивна хроматинова модификация) след ChIP-seq от BEF или BiPS клетки, както е посочено. (H) Диаграма на разсейване на H3K4me3 и H3K27me3 в BiPS клетки, илюстрираща присъствието на двувалентни хроматинови места в BiPS клетки. (I) RNA-seq, ATAC-seq и H3K4me3 или H3K27me3 ChIP-seq сигнали на избрани гени с известни роли в препрограмирането, които са активирани (Nanog, Kit) или потиснати (Thy1) в BiPS в сравнение с BEF клетки.

Ефектите от модифицирания метод на препрограмиране върху епигенетичните молекули на прилепите и хроматина бяха оценени с помощта на достъпен за транспозаза хроматин със секвениране (ATAC-seq) анализ. Извършени са също анализи за картографиране на метилом на дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) и анализи на имунопреципитация и секвениране на хроматин (ChIP-seq). Протоколите бяха оптимизирани, за да позволят SC диференциация на прилепи в трите зародишни слоя, докато анализът за диференциация на ембриоидни тела (EB) беше извършен за оценка на плурипотентността.

След това iPSCs на прилепи (BiPSCs) се инжектират в имуносупресирани мишки и от BiPSCs се създават ембрионални структури. Протоколът на изследването е валидиран чрез разработване на BiPS клетки от еволюционно отдалечения прилеп Myotis myotis.

Сравнително транскрипционно генно профилиране и анализи на главните компоненти (PCA) бяха извършени при вида прилеп Rhinolophus и филогенетично разнообразни видове бозайници от мишки, хора, кучета, прасета и мармозетки.

Беше извършен генен онтологичен анализ, за ​​да се оцени най-съвременното генно обогатяване за специфични биологични пътища. Разработени са нови тръбопроводи въз основа на метагеномна класификация на данни, секвенирани от рибонуклеинова киселина (РНК) на стволови клетки (RNA-seq), de novo предполагаемо сглобяване на ретровирусен контиг и геномно картографиране за идентифициране на добросъвестни ретровирусни показания. Освен това бяха изследвани антигенни маркери, свързани с РНК вируси.

Резултати от изследването

Специфично съотношение на фактор за препрограмиране, както и добавянето на фибробластен растежен фактор-2 (Fgf-2), фактор на стволови клетки (Scf), инхибиторен фактор на левкемия (Lif) и форсколин към културалната среда позволяват неинхибиран растеж на BiPSC, с хомогенни и плътни колонии от прилепи, появяващи се в рамките на 14 до 16 дни.

BiPSC експресират фактор на плурипотентност Oct4 при скорост на пролиферация, идентична на скоростта на пролиферация на човешки PSC. Повечето клетки съдържат 56 хромозоми и се репликират без екзогенни препрограмиращи фактори и морфологични промени.

BiPSCs се диференцират в трите зародишни слоя и впоследствие образуват EBs и органоиди. RNA-seq анализът показа индуцирана ендогенна експресия на канонични гени, свързани с плурипотентност, като SRY-2, Nanog и Oct4.

Въпреки това, генетичният профил не е напълно съвместим с плурипотентното състояние. Вместо това бяха експресирани наивни фактори на плурипотентно състояние като Klf4 и 17, бета протеин, свързан с естроген (Essrb), транскрипционен фактор E3 (Tfe3) и транскрипционен фактор CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Наблюдавани са коекспресиран Tfcp2l1/цинков пръстен протеин (Zic2) и Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, както и първични/нелекувани фактори.

Промени в конфигурацията на хроматина и метилирането на CpG 191 се наблюдават в целия геном на прилепа. Резултатите от ChiP-seq показват припокриване между гените за бивалентност на човека и прилепа, въпреки че някои гени са специфични за вида.

BiPSCs бяха транскрипционно и епигенетично препрограмирани. BIPSC бяха положителни за маркери за сдвоен бокс протеин (Pax6), 213T и алфа-фетопротеин (AFP) за ектодерма, мезодерма и ендодерма.

Генът ERAS беше регулиран надолу, докато гените за хиалуронидази и ADP-рибозилиращи фактори (ARFs) бяха неразличими между групите. Бластоидите на Rhinolophus показват ембрионални структури, свързани с израстък на сплескан трофобластен епител и вътрешно разширяване на клетъчната маса. Резултатите от прилепите Myotis предполагат, че протоколът от изследването може да се приложи към различни видове прилепи.

PCA анализът разкри отделна група стволови клетки от прилепи. Въпреки това, само осем топ гена показват значителна положителна селекция в R. ferrumequinum, като повечето гени принадлежат към неочаквани категории. Освен това CoV заболяването беше най-значително разширената категория в Енциклопедията на гените и геномите на Киото (KEGG).

Гените на колаген тип III алфа 1 (Col3a1) и муцин 1 (Muc1) бяха открити в BiPSC, което показва специфични за прилепите генетични адаптации. Препрограмирането разкрива ендогенни ретровирусни (ERV) последователности.

BiPSC съдържат множество свързани с вируса ендогенизирани последователности с региони, хомоложни на човешки херпесвирус 4, човешки респираторен синцитиален вирус и SARS-CoV-2 изолат. Геномните последователности на R. ferrumequinum са подобни на тези на човешки CoV 229E и човешки CoV OC43.

Бяха идентифицирани няколко места за ретровирусна интеграция, които бяха хомоложни на вируси като маймунския вирус Mason-Pfizer, вируса на коала и овчия ретровирус Jaagsiekte. Геномът е хомоложен на вирусите на волепокс, вариола, катерица, маймунска шарка и синдром на бяла шарка.

Изводи

BiPSC последователностите са подобни на последователностите на вирусния геном. По този начин, транскрипционно разрешаващото състояние на плурипотентност на прилепите може да бъде използвано за откриване на нови последователности на вируса на прилеп, участващи във физиологията на прилепите и техните способности за хостване на вируси.

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

препратки:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Ревизии на статиите

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.