Pluripotentní kmenové buňky netopýrů jako model pro studium nových virů

Pluripotentní kmenové buňky netopýrů jako model pro studium nových virů

Netopýři se vyvinuli s jedinečnými vlastnostmi, jako je echolokace hrtanu a let, přičemž někteří jsou schopni tolerovat viry, jako jsou koronaviry těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoVs), respirační syndrom CoV na Středním východě (MERS-CoVs) a viry Marburg a Nipah. Vývoj robustních modelů netopýrů založených na buňkách by mohl vést k lepšímu pochopení řízení netopýřích virů a jejich biologie.

V nedávno zveřejněné studii na toto téma bioRxiv * Předtiskový server: Výzkumníci vytvořili indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC) z netopýrů Rhinolophus ferrumequinum pomocí upraveného protokolu Yamanaka, aby se netopýři stali novým druhem modelové studie in vivo.

Studie: Pluripotentní kmenové buňky netopýrů odhalují jedinečné propojení hostitel-virus.Fotografický kredit: Jezper / Shutterstock.com

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

O studiu

V této studii vědci zkoumají, zda by netopýři mohli být vhodní pro produkci virů.

Byl použit přístup přeprogramování Yamanaka založený na přeprogramovacích faktorech, jako je gen Y-box-2 oblasti určující pohlaví, transkripční faktor 4 pro vazbu oktameru (Oct4), cMyc a faktor 4 podobný Kruppelovi (Klf4).

Buňky netopýřích embryonálních fibroblastů (BEF) byly izolovány z R. ferrumequinum s hladinami přeprogramovacích faktorů změněnými tak, aby aktivovaly a blokovaly více signálních drah. Kromě toho bylo také provedeno imunobarvení a sekvenování ribonukleové kyseliny (RNA) (RNA-seq).

Získání pluripotentních kmenových buněk netopýrů. (A) Ilustrace strategie pro získání pluripotentních kmenových buněk netopýrů. BEF, embryonální fibroblasty; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastové médium; PSC, médium pluripotentních kmenových buněk; PSC+, PSC s přísadami. (B) Morfologie zavedených BiPS buněčných kolonií pěstovaných na myších embryonálních fibroblastech. (C) Imunofluorescenční detekce Oct4 v buňkách BiPS. (D) MA graf dat RNA-seq ilustrující transkripční rozdíly mezi netopýřími embryonálními fibroblasty (BEF) a pluripotentními kmenovými buňkami (BiPS). Jsou zvýrazněny vybrané geny se známými funkcemi při vytváření nebo udržování pluripotence. (E) Kmean shluková analýza signálů ATAC-seq získaných z BEF nebo BiPS buněk. C, shluky. (F), graf hustoty výsledků RRBS získaných z buněk BEF a BiPS. PCC, Pearsonův korelační koeficient. (G) Rozptylové grafy stavu metylace histonu 3 v K4 (aktivující modifikace chromatinu) nebo K27 (represivní modifikace chromatinu) po ChIP-seq z buněk BEF nebo BiPS, jak je uvedeno. (H) Bodový graf H3K4me3 a H3K27me3 v BiPS buňkách ilustrující přítomnost bivalentních chromatinových míst v BiPS buňkách. (I) RNA-seq, ATAC-seq a H3K4me3 nebo H3K27me3 ChIP-seq signály vybraných genů se známými rolemi v přeprogramování, které jsou aktivovány (Nanog, Kit) nebo potlačeny (Thy1) v BiPS ve srovnání s BEF buňkami.

Účinky modifikované metody přeprogramování na netopýří epigenetické molekuly a chromatin byly hodnoceny pomocí testu chromatinu přístupného transpozáze se sekvenováním (ATAC-seq). Rovněž byly provedeny mapovací analýzy methylomu deoxyribonukleové kyseliny (DNA) a analýzy imunoprecipitace a sekvenování chromatinu (ChIP-seq). Protokoly byly optimalizovány tak, aby umožnily SC diferenciaci netopýrů do tří zárodečných vrstev, zatímco byl proveden diferenciační test embryoidního těla (EB) pro posouzení pluripotence.

Netopýří iPSC (BiPSC) byly poté injikovány do imunosuprimovaných myší a z BiPSC byly vytvořeny embryonální struktury. Protokol studie byl ověřen vyvinutím buněk BiPS z evolučně vzdáleného netopýra Myotis myotis.

Komparativní profilování transkripčních genů a analýzy hlavních komponent (PCA) byly provedeny u netopýra Rhinolophus a fylogeneticky různorodých savčích druhů myší, lidí, psů, prasat a kosmanů.

Byla provedena analýza genové ontologie za účelem posouzení nejmodernějšího genového obohacení pro specifické biologické dráhy. Nové pipeline byly vyvinuty na základě metagenomické klasifikace dat sekvenovaných ribonukleovou kyselinou (RNA) kmenových buněk (RNA-seq), de novo domnělého sestavení retrovirových kontigů a genomového mapování k identifikaci bona fide retrovirových čtení. Kromě toho byly zkoumány antigenní markery asociované s RNA viry.

Výsledky studie

Specifický poměr přeprogramovacího faktoru a také přidání fibroblastového růstového faktoru-2 (Fgf-2), faktoru kmenových buněk (Scf), leukemického inhibičního faktoru (Lif) a forskolinu do kultivačního média umožnily neinhibovaný růst BiPSC, přičemž homogenní a husté kolonie netopýrů se objevily během 14 až 16 dnů.

BiPSC exprimovaly faktor pluripotence Oct4 rychlostí proliferace identickou s rychlostí proliferace lidských PSC. Většina buněk obsahovala 56 chromozomů a replikovala se bez exogenních přeprogramovacích faktorů a morfologických změn.

BiPSC se diferencovaly do tří zárodečných vrstev a následně vytvořily EB a organoidy. Analýza RNA-seq ukázala indukovanou endogenní expresi kanonických genů souvisejících s pluripotenci, jako jsou SRY-2, Nanog a Oct4.

Genetický profil však nebyl zcela konzistentní se stavem pluripotence. Místo toho byly exprimovány naivní faktory pluripotentního stavu, jako jsou Klf4 a 17, estrogen-příbuzný receptor beta protein (Essrb), transkripční faktor E3 (Tfe3) a transkripční faktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Byly pozorovány koexprimovaný protein Tfcp2l1/zinkový prst (Zic2) a orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 a také primované/naivní faktory.

Změny v konfiguraci chromatinu a methylace CpG 191 byly pozorovány v celém genomu netopýra. Výsledky ChiP-seq ukázaly překrývání mezi lidskými a netopýřími bivalenčními geny, ačkoli některé geny byly druhově specifické.

BiPSC byly transkripčně a epigeneticky přeprogramovány. BIPSC byly pozitivní na markery paired box protein (Pax6), 213T a alfa-fetoprotein (AFP) pro ektoderm, mezoderm a endoderm.

Gen ERAS byl downregulován, zatímco geny pro hyaluronidázy a ADP-ribosylační faktory (ARF) byly mezi skupinami nerozlišitelné. Rhinolophus blastoids vykazovaly embryonální struktury vázané na zploštělý trofoblastický epiteliální růst a vnitřní expanzi buněčné hmoty. Výsledky netopýrů Myotis naznačovaly, že protokol studie by mohl být aplikován na různé druhy netopýrů.

Analýza PCA odhalila odlišnou skupinu netopýřích kmenových buněk. Pouze osm špičkových genů však vykazovalo významnou pozitivní selekci u R. ferrumequinum, přičemž většina genů patřila do neočekávaných kategorií. Kromě toho byla nemoc CoV nejvýrazněji rozšířenou kategorií v Kjótské encyklopedii genů a genomů (KEGG).

V BiPSC byly detekovány geny kolagenu typu III alfa 1 (Col3a1) a mucinu 1 (Muc1), což ukazuje na genetické adaptace specifické pro netopýry. Přeprogramování odhalilo sekvence endogenního retroviru (ERV).

BiPSC obsahovaly více endogenizovaných sekvencí spojených s virem s oblastmi homologními k lidskému herpesviru 4, lidskému respiračnímu syncytiálnímu viru a izolátu SARS-CoV-2. Genomové sekvence R. ferrumequinum byly podobné sekvencím lidského CoV 229E a lidského CoV OC43.

Bylo identifikováno několik retrovirových integračních míst, která byla homologní s viry, jako je Mason-Pfizer opičí virus, koala virus a ovčí retrovirus Jaagsiekte. Genom byl homologní s viry volepox, variola, veverčí neštovice, opičí neštovice a syndrom bílých neštovic.

Závěry

BiPSC sekvence byly podobné sekvencím virového genomu. Stav transkripčně permisivní pluripotence netopýrů by tedy mohl být využit k objevení nových sekvencí netopýřích virů zapojených do fyziologie netopýrů a jejich schopností hostit viry.

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revize článku

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.