Pluripotente flagermusstamceller som en model til at studere nye vira

Pluripotente flagermusstamceller som en model til at studere nye vira

Flagermus har udviklet sig med unikke egenskaber såsom larynx-ekkolokalisering og flugt, hvor nogle er i stand til at tolerere vira såsom alvorlige akutte respiratoriske syndrom-coronavirusser (SARS-CoVs), Mellemøstens respiratoriske syndrom-CoVs (MERS-CoVs) og Marburg- og Nipah-vira. Udviklingen af ​​robuste cellebaserede flagermusmodeller kan føre til en bedre forståelse af flagermusvirushåndtering og deres biologi.

I en nyligt offentliggjort undersøgelse om emnet bioRxiv * Preprint-server: Forskere genererede inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) fra Rhinolophus ferrumequinum-flagermus ved hjælp af den modificerede Yamanaka-protokol til at etablere flagermus som en ny in vivo modelundersøgelsesart.

Studere: Bat pluripotente stamceller afslører unik vært-virus sammenkobling.Fotokredit: Jezper / Shutterstock.com

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Om studiet

I nærværende undersøgelse undersøger forskere, om flagermus kunne være egnet til virusproduktion.

Yamanaka-omprogrammeringstilgangen blev brugt baseret på omprogrammeringsfaktorer såsom det kønsbestemmende område Y-box-2-gen, oktamerbindende transkriptionsfaktor 4 (Oct4), cMyc og Kruppel-lignende faktor 4 (Klf4).

Flagermus embryonale fibroblastceller (BEF) blev isoleret fra R. ferrumequinum med niveauer af omprogrammeringsfaktorer ændret for at aktivere og blokere flere signalveje. Derudover blev der også udført immunfarvning og ribonukleinsyre (RNA) sekventerings (RNA-seq) analyser.

At opnå pluripotente flagermusstamceller. (A) Illustration af strategien til opnåelse af pluripotente flagermusstamceller. BEF, embryonale fibroblaster; OSMK, Okt4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastmedium; PSC, pluripotent stamcellemedium; PSC+, PSC med tilsætningsstoffer. (B) Morfologi af etablerede BiPS-cellekolonier dyrket på museembryonale fibroblaster. (C) Immunfluorescensdetektion af Oct4 i BiPS-celler. (D) MA-plot af RNA-seq-data, der illustrerer de transkriptionelle forskelle mellem flagermusembryonale fibroblaster (BEF) og pluripotente stamceller (BiPS). Udvalgte gener med kendte funktioner til at etablere eller opretholde pluripotens er fremhævet. (E) Kmean klyngeanalyse af ATAC-seq-signaler opnået fra BEF- eller BiPS-celler. C, klynger. (F), Densitetsplot af RRBS-resultater opnået fra BEF- og BiPS-celler. PCC, Pearson korrelationskoefficient. (G) Scatterplots af histon 3-methyleringsstatus ved K4 (aktiverende kromatinmodifikation) eller K27 (repressiv kromatinmodifikation) efter ChIP-seq fra BEF- eller BiPS-celler, som angivet. (H) Scatterplot af H3K4me3 og H3K27me3 i BiPS-celler, der illustrerer tilstedeværelsen af ​​bivalente kromatinsteder i BiPS-celler. (I) RNA-seq, ATAC-seq og H3K4me3 eller H3K27me3 ChIP-seq signaler af udvalgte gener med kendte roller i omprogrammering, som er aktiveret (Nanog, Kit) eller undertrykt (Thy1) i BiPS sammenlignet med BEF-celler.

Virkningerne af den modificerede omprogrammeringsmetode på flagermus epigenetiske molekyler og kromatin blev vurderet ved hjælp af det transposase-tilgængelige kromatin med sekventering (ATAC-seq) assay. Deoxyribonukleinsyre (DNA) methylomkortlægningsanalyser og kromatinimmunpræcipitation og sekventeringsanalyser (ChIP-seq) blev også udført. Protokoller blev optimeret til at tillade SC-differentiering af flagermus i de tre kimlag, mens embryoid krop (EB) differentieringsassay blev udført for at vurdere pluripotens.

Bat iPSC'er (BiPSC'er) blev derefter injiceret i immunsupprimerede mus, og embryonale strukturer blev skabt ud fra BiPSC'erne. Studieprotokollen blev valideret ved at udvikle BiPS-celler fra den evolutionært fjerne flagermus Myotis myotis.

Sammenlignende transkriptionel genprofilering og principal komponentanalyser (PCA) blev udført i flagermus-arten Rhinolophus og fylogenetisk forskellige pattedyrarter af mus, mennesker, hunde, grise og silkeaber.

Genontologianalyse blev udført for at vurdere state-of-the-art genberigelse for specifikke biologiske veje. Nye pipelines er blevet udviklet baseret på metagenomisk klassificering af stamcelle-ribonukleinsyre (RNA)-sekventerede (RNA-seq) data, de novo formodet retroviral contig-samling og genomisk kortlægning for at identificere bona fide retrovirale aflæsninger. Derudover blev antigenmarkører forbundet med RNA-vira undersøgt.

Studieresultater

Et specifikt omprogrammeringsfaktorforhold samt tilføjelsen af ​​fibroblastvækstfaktor-2 (Fgf-2), stamcellefaktor (Scf), leukæmihæmmende faktor (Lif) og forskolin til dyrkningsmediet muliggjorde uhæmmet BiPSC-vækst, med homogene og tætte flagermuskolonier, der dukkede op inden for 14 til 16 dage.

BiPSC'er udtrykte Oct4 pluripotensfaktor ved en spredningshastighed identisk med spredningshastigheden for humane PSC'er. De fleste celler indeholdt 56 kromosomer og replikerede uden eksogene omprogrammeringsfaktorer og morfologiske ændringer.

BiPSC'er differentierede i de tre kimlag og dannede efterfølgende EB'er og organoider. RNA-seq-analyse viste induceret endogen ekspression af kanoniske pluripotens-relaterede gener såsom SRY-2, Nanog og Oct4.

Den genetiske profil var dog ikke helt i overensstemmelse med en pluripotenstilstand. I stedet blev naive pluripotente tilstandsfaktorer som Klf4 og 17, østrogenrelateret receptor betaprotein (Essrb), transkriptionsfaktor E3 (Tfe3) og transkriptionsfaktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1) udtrykt. Samudtrykt Tfcp2l1/zinkfingerprotein (Zic2) og Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 såvel som primede/naive faktorer blev observeret.

Ændringer i kromatinkonfiguration og CpG 191-methylering blev observeret i hele flagermusgenomet. ChiP-seq resultater viste overlap mellem humane og flagermus bivalensgener, selvom nogle gener var artsspecifikke.

BiPSC'er blev transskriptionelt og epigenetisk omprogrammeret. BIPSC'er var positive for parret boksprotein (Pax6), 213T og alfa-føtoprotein (AFP) markører for ektoderm, mesoderm og endoderm.

ERAS-genet blev nedreguleret, hvorimod generne for hyaluronidaser og ADP-ribosyleringsfaktorer (ARF'er) ikke kunne skelnes mellem grupper. Rhinolophus blastoider viste embryonale strukturer bundet til en fladtrykt trofoblastisk epiteludvækst og intern cellemasseudvidelse. Resultaterne fra Myotis flagermus antydede, at undersøgelsesprotokollen kunne anvendes på forskellige flagermusarter.

PCA-analyse afslørede en særskilt gruppe af flagermusstamceller. Imidlertid viste kun otte topgener signifikant positiv selektion i R. ferrumequinum, hvor de fleste gener tilhørte uventede kategorier. Desuden var CoV-sygdom den mest signifikant udvidede kategori i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Kollagen type III alpha 1 (Col3a1) og mucin 1 (Muc1) gener blev påvist i BiPSCs, hvilket indikerer flagermus-specifikke genetiske tilpasninger. Omprogrammeringen afslørede endogene retrovirus (ERV) sekvenser.

BiPSC'er indeholdt flere virus-associerede endogeniserede sekvenser med regioner homologe med human herpesvirus 4, human respiratorisk syncytialvirus og et SARS-CoV-2-isolat. De genomiske sekvenser af R. ferrumequinum svarede til dem for human CoV 229E og human CoV OC43.

Adskillige retrovirale integrationssteder blev identificeret, som var homologe med vira, såsom Mason-Pfizer abevirus, koalavirus og Jaagsiekte fåreretrovirus. Genomet var homologt med vira af voskopper, variola, egernkopper, abekopper og hvidkoppersyndrom.

Konklusioner

BiPSC-sekvenser lignede virale genomsekvenser. Således kunne flagermusens transkriptionelt tilladelige pluripotenstilstand udnyttes til at opdage nye flagermusvirussekvenser involveret i flagermusens fysiologi og deres virusværtsevner.

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Referencer:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artikel revisioner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.