Πολυδύναμα βλαστοκύτταρα νυχτερίδας ως μοντέλο για τη μελέτη νέων ιών

Πολυδύναμα βλαστοκύτταρα νυχτερίδας ως μοντέλο για τη μελέτη νέων ιών

Οι νυχτερίδες έχουν εξελιχθεί με μοναδικά χαρακτηριστικά όπως ηχοεντοπισμός του λάρυγγα και πτήση, με ορισμένες να μπορούν να ανέχονται ιούς όπως κοροναϊούς σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS-CoVs), CoVs με αναπνευστικό σύνδρομο Μέσης Ανατολής (MERS-CoVs) και ιούς Marburg και Nipah. Η ανάπτυξη ισχυρών μοντέλων νυχτερίδων που βασίζονται σε κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της διαχείρισης του ιού των νυχτερίδων και της βιολογίας τους.

Σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη για το θέμα bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Οι ερευνητές δημιούργησαν επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) από νυχτερίδες Rhinolophus ferrumequinum χρησιμοποιώντας το τροποποιημένο πρωτόκολλο Yamanaka για να καθιερώσουν τις νυχτερίδες ως νέο είδος μελέτης μοντέλου in vivo.

Μελέτη: Τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα νυχτερίδας αποκαλύπτουν μοναδική διασύνδεση ξενιστή-ιού.Φωτογραφία: Jezper / Shutterstock.com

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές διερευνούν εάν οι νυχτερίδες θα μπορούσαν να είναι κατάλληλες για παραγωγή ιών.

Η προσέγγιση επαναπρογραμματισμού Yamanaka χρησιμοποιήθηκε με βάση παράγοντες επαναπρογραμματισμού όπως το γονίδιο Y-box-2 της περιοχής καθορισμού του φύλου, ο μεταγραφικός παράγοντας 4 που δεσμεύει το οκταμερές (Oct4), ο cMyc και ο παράγοντας 4 που μοιάζει με Kruppel (Klf4).

Κύτταρα εμβρυϊκών ινοβλαστών νυχτερίδας (BEF) απομονώθηκαν από R. ferrumequinum με επίπεδα παραγόντων επαναπρογραμματισμού αλλαγμένα για να ενεργοποιήσουν και να μπλοκάρουν πολλαπλές οδούς σηματοδότησης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν επίσης αναλύσεις ανοσοχρώσης και προσδιορισμού αλληλουχίας ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) (RNA-seq).

Λήψη πολυδύναμων βλαστοκυττάρων νυχτερίδας. (Α) Απεικόνιση της στρατηγικής για τη λήψη πολυδύναμων βλαστοκυττάρων νυχτερίδας. BEF, εμβρυϊκοί ινοβλάστες; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, μέσο ινοβλαστών; PSC, πολυδύναμο μέσο βλαστοκυττάρων. PSC+, PSC με πρόσθετα. (Β) Μορφολογία εγκατεστημένων αποικιών κυττάρων BiPS που αναπτύχθηκαν σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού. (Γ) Ανίχνευση ανοσοφθορισμού του Oct4 σε κύτταρα BiPS. (D) γραφική παράσταση ΜΑ δεδομένων RNA-seq που απεικονίζουν τις μεταγραφικές διαφορές μεταξύ εμβρυϊκών ινοβλαστών νυχτερίδας (BEF) και πολυδύναμων βλαστοκυττάρων (BiPS). Τονίζονται επιλεγμένα γονίδια με γνωστές λειτουργίες για τη δημιουργία ή τη διατήρηση της πολυδύναμης. (Ε) Ανάλυση συστάδας Kmean των σημάτων ATAC-seq που λαμβάνονται από κύτταρα BEF ή BiPS. Γ, συστάδες. (F), Διάγραμμα πυκνότητας των αποτελεσμάτων RRBS που ελήφθησαν από κύτταρα BEF και BiPS. PCC, συντελεστής συσχέτισης Pearson. (Ζ) Διαγράμματα διασποράς της κατάστασης μεθυλίωσης της ιστόνης 3 στο Κ4 (ενεργοποίηση τροποποίησης χρωματίνης) ή Κ27 (τροποποίηση κατασταλτικής χρωματίνης) μετά από το ChIP-seq από κύτταρα BEF ή BiPS, όπως υποδεικνύεται. (Η) Διάγραμμα διασποράς των H3K4me3 και H3K27me3 σε κύτταρα BiPS που απεικονίζει την παρουσία θέσεων δισθενούς χρωματίνης σε κύτταρα BiPS. (I) RNA-seq, ATAC-seq και H3K4me3 ή H3K27me3 σήματα ChIP-seq επιλεγμένων γονιδίων με γνωστούς ρόλους στον επαναπρογραμματισμό που ενεργοποιούνται (Nanog, Kit) ή καταστέλλονται (Thy1) σε BiPS σε σύγκριση με κύτταρα BEF.

Τα αποτελέσματα της τροποποιημένης μεθόδου επαναπρογραμματισμού στα επιγενετικά μόρια της νυχτερίδας και στη χρωματίνη αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την προσβάσιμη στην τρανσποζάση χρωματίνη με προσδιορισμό αλληλουχίας (ATAC-seq). Πραγματοποιήθηκαν επίσης αναλύσεις χαρτογράφησης μεθυλώματος δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) και αναλύσεις ανοσοκατακρήμνισης και προσδιορισμού αλληλουχίας χρωματίνης (ChIP-seq). Τα πρωτόκολλα βελτιστοποιήθηκαν για να επιτρέπουν την SC διαφοροποίηση των νυχτερίδων στα τρία βλαστικά στρώματα, ενώ πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία διαφοροποίησης του εμβρυϊκού σώματος (EB) για την αξιολόγηση της πολυδυναμίας.

Τα iPSC της νυχτερίδας (BiPSCs) στη συνέχεια εγχύθηκαν σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια και δημιουργήθηκαν εμβρυϊκές δομές από τα BiPSC. Το πρωτόκολλο της μελέτης επικυρώθηκε με την ανάπτυξη κυττάρων BiPS από την εξελικτικά μακρινή νυχτερίδα Myotis myotis.

Συγκριτικό προφίλ μεταγραφής γονιδίου και αναλύσεις κύριων συστατικών (PCA) διεξήχθησαν στο είδος νυχτερίδας Rhinolophus και σε φυλογενετικά διαφορετικά είδη θηλαστικών ποντικών, ανθρώπων, σκύλων, χοίρων και μαρμόζων.

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση γονιδιακής οντολογίας για την αξιολόγηση του εμπλουτισμού γονιδίων τελευταίας τεχνολογίας για συγκεκριμένα βιολογικά μονοπάτια. Έχουν αναπτυχθεί νέοι αγωγοί με βάση τη μεταγονιδιωματική ταξινόμηση δεδομένων με αλληλουχία ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) βλαστοκυττάρων (RNA-seq), de novo υποτιθέμενη συγκρότηση ρετροϊού και γονιδιωματική χαρτογράφηση για τον εντοπισμό καλόπιστων αναγνώσεων ρετροϊού. Επιπλέον, εξετάστηκαν αντιγονικοί δείκτες που σχετίζονται με ιούς RNA.

Αποτελέσματα μελέτης

Μια ειδική αναλογία παράγοντα επαναπρογραμματισμού καθώς και η προσθήκη του αυξητικού παράγοντα-2 ινοβλαστών (Fgf-2), του παράγοντα βλαστοκυττάρων (Scf), του ανασταλτικού παράγοντα λευχαιμίας (Lif) και της φορσκολίνης στο μέσο καλλιέργειας επέτρεψαν την μη αναστολή της ανάπτυξης BiPSC, με ομοιογενείς και πυκνές αποικίες νυχτερίδων να εμφανίζονται μέσα σε 14 έως 1 ημέρες.

Τα BiPSC εξέφρασαν τον παράγοντα πολυδυναμίας Oct4 με ρυθμό πολλαπλασιασμού πανομοιότυπο με το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων PSC. Τα περισσότερα κύτταρα περιείχαν 56 χρωμοσώματα και αναδιπλασιάζονταν χωρίς εξωγενείς παράγοντες επαναπρογραμματισμού και μορφολογικές αλλαγές.

Τα BiPSC διαφοροποιήθηκαν στα τρία βλαστικά στρώματα και στη συνέχεια σχημάτισαν EBs και οργανοειδή. Η ανάλυση RNA-seq έδειξε επαγόμενη ενδογενή έκφραση κανονικών γονιδίων που σχετίζονται με την πολυδύναμη, όπως τα SRY-2, Nanog και Oct4.

Ωστόσο, το γενετικό προφίλ δεν ήταν απολύτως συνεπές με μια κατάσταση πολυδυναμίας. Αντίθετα, εκφράστηκαν πρωτογενείς παράγοντες πολυδύναμου κατάστασης όπως οι Klf4 και 17, η πρωτεΐνη βήτα υποδοχέα που σχετίζεται με οιστρογόνα (Essrb), ο μεταγραφικός παράγοντας E3 (Tfe3) και ο μεταγραφικός παράγοντας CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Παρατηρήθηκαν συνεκφρασμένη πρωτεΐνη δακτύλου Tfcp2l1/ψευδαργύρου (Zic2) και Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 καθώς και αρχικοί/απαλλαγμένοι παράγοντες.

Αλλαγές στη διαμόρφωση χρωματίνης και μεθυλίωση CpG 191 παρατηρήθηκαν σε όλο το γονιδίωμα της νυχτερίδας. Τα αποτελέσματα του ChiP-seq έδειξαν επικάλυψη μεταξύ γονιδίων δισθενούς ανθρώπου και νυχτερίδας, αν και ορισμένα γονίδια ήταν ειδικά για τα είδη.

Τα BiPSC επαναπρογραμματίστηκαν μεταγραφικά και επιγενετικά. Τα BIPSC ήταν θετικά για δείκτες ζευγαρωμένης πρωτεΐνης κουτιού (Pax6), 213T και άλφα-εμβρυοπρωτεΐνης (AFP) για το εξώδερμα, το μεσόδερμα και το ενδόδερμα.

Το γονίδιο ERAS ρυθμίστηκε προς τα κάτω, ενώ τα γονίδια για τις υαλουρονιδάσες και τους παράγοντες ADP-ριβοζυλίωσης (ARFs) ήταν δυσδιάκριτα μεταξύ των ομάδων. Τα βλαστοειδή Rhinolophus έδειξαν εμβρυϊκές δομές συνδεδεμένες με μια πεπλατυσμένη τροφοβλαστική επιθηλιακή ανάπτυξη και εσωτερική επέκταση της κυτταρικής μάζας. Τα αποτελέσματα των νυχτερίδων Myotis πρότειναν ότι το πρωτόκολλο της μελέτης θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε διαφορετικά είδη νυχτερίδων.

Η ανάλυση PCA αποκάλυψε μια ξεχωριστή ομάδα βλαστικών κυττάρων νυχτερίδας. Ωστόσο, μόνο οκτώ κορυφαία γονίδια έδειξαν σημαντική θετική επιλογή στο R. ferrumequinum, με τα περισσότερα γονίδια να ανήκουν σε απροσδόκητες κατηγορίες. Επιπλέον, η νόσος CoV ήταν η πιο σημαντικά διευρυμένη κατηγορία στην Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG).

Τα γονίδια κολλαγόνου τύπου III άλφα 1 (Col3a1) και βλεννίνης 1 (Muc1) ανιχνεύθηκαν σε BiPSC, υποδεικνύοντας γενετικές προσαρμογές ειδικών για νυχτερίδες. Ο επαναπρογραμματισμός αποκάλυψε αλληλουχίες ενδογενούς ρετροϊού (ERV).

Τα BiPSCs περιείχαν πολλαπλές ενδογενοποιημένες αλληλουχίες που σχετίζονται με τον ιό με περιοχές ομόλογες με τον ανθρώπινο ιό έρπητα 4, τον ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό και ένα στέλεχος SARS-CoV-2. Οι γονιδιωματικές αλληλουχίες του R. ferrumequinum ήταν παρόμοιες με εκείνες του ανθρώπινου CoV 229E και του ανθρώπινου CoV OC43.

Εντοπίστηκαν αρκετές θέσεις ενσωμάτωσης ρετροϊών που ήταν ομόλογες με ιούς όπως ο ιός πιθήκων Mason-Pfizer, ο ιός κοάλα και ο ρετροϊός προβάτων Jaagsiekte. Το γονιδίωμα ήταν ομόλογο με τους ιούς volepox, variola, squirrelpox, monkeypox και whitepox syndrome.

συμπεράσματα

Οι αλληλουχίες BiPSC ήταν παρόμοιες με τις αλληλουχίες ιικού γονιδιώματος. Έτσι, η μεταγραφικά επιτρεπτή κατάσταση πολυδυναμίας των νυχτερίδων θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για να ανακαλυφθούν νέες αλληλουχίες ιών νυχτερίδων που εμπλέκονται στη φυσιολογία των νυχτερίδων και στις ικανότητές τους να φιλοξενούν ιούς.

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Παραπομπές:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Αναθεωρήσεις άρθρου

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.